這種做法到最後往往需要重新構建並篩選新的cDNA文庫

然而，在許多情況下，這種做法的結果常常更令人失望和充滿挫敗感。往往不得不重新構建並篩選新的cDNA文庫。在20世紀80年代後期，Frohman 等（1988）發現一種更好的方法，即用傳統的PCR方法擴增cDNA的5‘端序列。

這一方法不同於傳統的 PCR，它只需要知道靶RNA或cDNA上的一部分序列（圖7-4）。5’-RACE可分為三個步驟。步驟A，引物透過反轉錄延伸獲得與mRNA 5‘端互補的序列。

步驟B，在cDNA的3’端加入一個同聚尾或引物接頭，這樣在靶mRNA的5‘端未知序列區會產生一個引物結合位點。步驟C，使用基因特異引物和上游引物合成cDNA的第二鏈並擴增出雙鏈cDNA。

步驟C產生的雙鏈DNA可純化並克隆入載體，進行測序分析和後續實驗。圖7-4 5’-RACE 實驗確定mRNA的5’端序列。（A）與已知序 列特定區域互補的序列特異性引物1與RNA樣品復性。

用反轉錄酶和dNTP透過酶促反應獲得cDNA第一鏈。 （B）利用旋轉透析從反應產物中去除多餘的引物。

第一鏈 DNA的3‘’端用末端轉移酶催化並進行同聚物加尾，典型方法是透過dATP來產生poly （dA）尾，然而，一些研究者更喜歡用dCTP產生poly （dC）尾，尤其對RNA末端已經存在多個A更是如此。

（C）用（dT）r接頭引物來引導合成cDNA的第二鏈，透過擴增反應產生足夠的產量用於克隆到質粒載體和後續的序列分析。5’-RACE不像聽起來那樣既簡單又有效。