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為什麼要加入總離子強度調節緩衝劑

論文獨創性宣告

本人是在指導老師幫助指導下，本人單獨進行實驗研究和開發工作。所取得的成果皆為本人所屬。除文中已特別加以註明引用的內容外，論文中不包含任何其他個人或集體已經發表或撰寫過的研究成果。對本文的工作做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明並致謝。本宣告的法律結果由本人承擔。

特此宣告。

論文作者（簽名）：

年 月 日

摘

要

酪氨酸酶又稱多酚氧化酶或兒茶酚氧化酶具有重要的生化特性，廣泛的存在微生物、動、植物體中。酪氨酸酶在醫藥製備、有機合成、精細化工等領域具有廣泛的用途，因此對酪氨酸酶的研究應用受到廣泛重視。本文就酪氨酸酶在有機合成、醫藥製備、環境保護、提取分析等方面的研究進展進行論述。

由於鄰苯二酚在酶和氧存在條件下可迅速轉變成鄰苯醌，在波長410-480nm下有吸收，因此，可以透過測定鄰苯二酚轉變成鄰苯醌的速率來表示酶活性。（酶的活性單位定義在25℃時最佳化的條件下（PH，離子強度等）在一分鐘內轉化1umol底物所需要的量）。所以實驗部分是利用分光光度計測定酪氨酸酶與鄰二苯酚反應生成的醌在415nm波長下吸光度，利用醌的吸光度變化與時間的比值來表示酶的活性單，再利用斜率來計算原料中酶活性。這為探究酶活性的影響因素提供了依據。透過測定不同溫度不同PH環境下的酶活性得出酶在30℃左右中性環境下活性最大，無機鹽對酶的影響是永久失活的結論。這為以後酶的使用環境、安全儲運條件提供依據。

關鍵詞

：

酪氨酸酶；應用；提取；分析

Abstract

Tyrosinase， also known as polyphenol oxidase or catechol oxidase， has important biochemical properties， and a wide range of microorganisms exist in plants and animals。Tyrosinase is widely used in chemical fields in pharmaceutical preparation， organic synthesis，so the research and application of tyrosinase has attracted wide attention。In this paper， tyrosinase will be discussed in organic synthesis， pharmaceutical preparation， environmental protection， research progress of extraction and analysis 。

Because of catechol can be quickly converted into o-benzoquinone with the presence of enzymes and oxygen，and o-benzoquinone has absorption at wavelength 410-480nm。Therefore， enzyme activity can be indicated by determining the rate at which catechol is converted to ortho quinone （the active unit of an enzyme defines the amount required to convert the 1umol substrate in a minute at an optimum temperature of 25 ℃ 。So the part of the experiment is using spectrophotometric determine absorbance at 415nm wavelength of o-quinone that was reacted to form by Tyrosinase and Catechol，the activity ratio of the enzyme is expressed by the ratio of the change of the absorbance of quinone to the time， and then the slope is used to calculate the enzyme activity in the raw material。It provides a basis for the study of influencing factors of enzyme activity。Through the determination of enzyme activity at different temperatures and different PH environment，the enzyme at about 30 ℃ neutral environment maximum activity， effect of inorganic salts on enzyme inactivation of the conclusion is permanent。It provides the basis for the use of enzymes and the safe storage and transportation conditions in the future。

Keywords

：

Tyrosinase； Application； Extraction； Analysis

目錄

果蔬提取物中酪氨酸酶測定方法的研究

1文獻綜述

酪氨酸酶別名酚氧化酶、兒茶酚氧化酶或多酚氧化酶［1］。參與黑素的合成，有催化限速功效［2］。1895年，有人見到剛採的蘑菇為紅色，放一段時間後變黑了，從那以後認識酪氨酸酶，隨著科學家不斷探究證明生物生長各階段都有酪氨酸酶的出現。酪氨酸酶在各生物體內作用環境不同表達的效能也不同。科學家們開始探究酪氨酸酶是由於它能參與兩個反應：能參與鄰二酚反應氧化其生成醌；能羥基化單酚生成鄰二酚以單酚酶的形式參與其中［3］。目前，商品化的酪氨酸酶主要是從蘑菇中提取［4］。在醫藥合成、環境保護、精細化工方面扮演著重要角色。

1。1酶的發展史

人類對酶的瞭解是透過對發酵食品和消化作用的探究慢慢演變的。很久以前古代人們就懂得將一些藥料加入酒裡來治病。而酒是酵母發酵的產品，是細胞酶的作用的結果。在公元10世紀左右，古書中顯示人們會用豆類植物做醬。而它的製作過程是黴菌蛋白酶水解豆中蛋白質得到的。約3000年前，古人利用含澱粉酶的麥穗將澱粉降解為麥芽糖。1752年有人做實驗將肉片裝在金屬籠子裡，然後餵給老鷹，一段時間過後取出金屬籠子，發現肉片被消化了。開始思考是否存在某些物質消耗掉了肉片而不是大腸蠕動的結果。這些事表明，人類在很早就已經跟酶接觸，知道他的存在與作用，但是正確瞭解酶，科學的利用酶是在近現代時間。1852年，科學家們關於酵母如何發酵提出了不同的觀點。以化學家利比希（Libig）為首的學派認為酵母發酵生成酒精是一種有機化學反應，而法國細菌學家巴斯德則認為發酵是由於酵母細胞活動的結果。兩種說法並存了半個世紀，直到巴氏死後三年1897年，德國化學家彪赫納（Buchuer）兄弟發現酵母細胞用砂磨碎後的無細胞提取液加到蔗糖溶液後也能也起發酵過程，將一份子的葡萄糖轉化為2分子乙醇和2分子的二氧化碳。這才意識到無細胞結構也可發酵的事實，同時結束了這場有名的爭論。這一認識很快被應用於其他細胞參與的反應中，為人類日後在細胞外的條件下應用酶生產化合物奠定了基礎。在1876年德國的屈內（Kuhne）對於酵母中引發發酵的因素起了一個名字—enzyme。1878年屈內（Kuhne）首次提出“酶”的概念，此字源於希臘文由“En（在）”和“Zyme（酵母）”組合而成，表示酶存在酵母中。

20世紀以來，酶學研究發展迅速。1902年亨利（Henri）提出了中間產物的學說，他透過實驗認定底物要與酶形成中間產物，最後生成最終產物，酶在其中沒有發生變化可被從新收集。1913年，Leonor Michaelis和Lenora Menten根據中間產物學說推匯出酶催化反應動力學的著名 Michaelis- Menten方程簡稱米氏方程（v=Vm［S］/Km+［S］）。這一學說的提出是酶反應機理路程上的一個重大里程碑。1925年George E。和J。B。S。Handane對米氏方程作了修正，提出了擬穩態學說。20世紀出，沙姆那透過刀豆實驗提出酶是蛋白質的觀點，之後科學家們正式的證實了這一觀點。之後人們開始了對酶以蛋白質的形式的研究。

隨著科學的發展，對酶的認識從生物階段到化學階段，20世紀以來不斷融合，出現了生物化學實驗手段。酶工程就是典型的生物化學技術之一。酶工程涉及到的技術通常有：分離純化；酶蛋白的化學修飾；酶的固定化；酶的修飾；酶化學交聯；酶分子的定向改造。酶的生產純化在實際應用中得到廣泛的重視。隨著科學急速發展純化酶的技術也從簡單的離心分離到層析技術、超離心分離、紫外分光分析、紅外分析等高科技手段。使酶可以被製成單一的蛋白質，這為以後的酶學研究創下有利條件。

1。2酪氨酸酶的結構

圖

1.2 酪氨酸酶的活性中心結構

由圖可以看出，酪氨酸酶是一種銅酶，在結構上兩個銅離子位於其活性中心經分析Cu-Cu的鍵長是0。35nm。催化反應時其位點分別以氧化態、還原態、和脫氧態三種形態參與其中。三種形態中的氧化態是指活性中心周圍環境中的氧以氧化物的形肽和銅離子反應合成配位鍵，在中心銅離子的兩個赤道面位置形成橋聯配體連結著兩個銅離子。還原態的結構能用O-Cu解釋，還原態酪氨酸酶與氧化態不同的的是它的橋聯配體是氫氧化物不是氧化物的形式，並且它們的電子構象也不同氧化態的為3d9還原態的為3d10。脫氧態酪氨酸酶指酪氨酸酶結構中兩個銅的價態不同，一個是2價銅離子，另外的是1價的亞銅離子。對脫氧態酪氨酸酶的結構分析發現其活性中心的2價銅離子存在有未配對的電子，而該電子存在於dx2-y2軌道。後來研究表明脫氧態酪氨酸酶的兩個價態的銅離子之間也存在著橋聯配體，但是具體尚不明確。

1。3酪氨酸酶的生物學功能

酪氨酸酶在不同種類生物體內名字不同。在昆蟲體內稱作酚氧化酶，在植物體內稱為多酚氧化酶，在微生物和人體內常稱為酪氨酸酶。

大部分昆蟲體內無變異情況下酪氨酸酶以酶原（無活性酶前體）的狀態分佈在細胞內。當受到病原微生物攻擊情況下，昆蟲免疫系統會經絲氨酸蛋白酶級聯途徑切除酚氧化酶原N-端50多個氨基酸，使其成為活化狀態。活化的酚氧化酶參與機體的防禦反應和傷口癒合生理過程［5］。在受傷感染情況下，血細胞發生脫粒（細胞向外釋放顆粒狀物質），並與其他的血細胞集中起來，集中起來的聚集體把外來物包埋並把傷口覆蓋，變為凝膠塊；酚氧化酶原被血細胞分泌出，並被活化，用於催化酚類反應生醌，覆蓋在傷口處，醌接著反應生成黑色素；然後，吞噬細胞來到傷口凝結處，把凝結部分和傷口內部分隔開，就這樣覆蓋在表面形成黑色素來減少傷口的擴張面積。昆蟲的蛻皮反應中酶參與鞣化反應，鞣化激素在血細胞中把酶活化，然後酪氨酸進入表層細胞中，經酶催化形成N-乙醯多巴胺，並在上表皮細胞被氧化成醌，醌再擴散與遊離氨基酸或蛋白質末端的氨基發生交聯，產生不溶性的鞣化蛋白，從而使表皮硬化或暗化，並充分伸展［6，7］。昆蟲中酶還參加生成硬化角質用來為無椎動物提供保護層。

圖1

.3.1

酪氨酸酶催化酪氨酸生成黑色素

哺乳動物體內，黑素細胞記憶體在較多酪氨酸酶。黑素細胞產生色素的高度特異性細胞，常見於面板、發囊和眼睛中。酪氨酸酶催化生成的黑色素會從黑素細胞中出來並進入皮層細胞中改變皮層顏色，阻抗紫外線輻射來保護眼睛和面板並調控身體內溫度預防溫度過高。酪氨酸酶的失活或缺失通常會引起人和動物的常染色體疾病，例如白化病，當用來合成酪氨酸酶的基因出現隱性突變或從雙親遺傳的是一對隱性基因，機體自身沒法合成此酶，就會引起阻礙體內黑色素的形成，黑色豎不足的結果就會引起機體變白，不宜在紫外線強烈的條件下活動。酪氨酸酶活性增強時也會引起色素性疾病，例如黃褐斑。當酪氨酸酶活性增強時，黑色素的產生也會變多，但是身體細胞代謝黑色素的能力不增加或有所減弱，黑色素不能正常代謝到體外，長時間積累就會產生黃褐斑［8］。

黑素細胞通常分佈在表層基層細胞間，細胞內的酪氨酶可催化酪氨酸被羥化反應形成 L-3，4-二羥基丙氨酸，接著將L-3，4-二羥基丙氨酸氧化生成多巴醌。生成的醌再由2個相異的反應路程合成真黑素與褪黑素：生成真黑素是醌透過多聚化生成無色多巴色素，生成的色素很活潑會迅速與多巴醌反應生為多巴色素，多巴色素再過異構、脫羧反應為二羥基吲哚，吲哚會被酪氨酸酶催化反應為真黑素；褪黑素的合成是多巴醌和半胱氨酸（Cys）反應生成5-半胱氨酸-多巴和5-半胱氨酸-多巴醌，再經過成環、脫羧變成苯肼噻嗪的衍生物，最後形成黑素（機理見圖1。3。1）［6，9，10，11，12］。酪氨酸酶活性提高，合成的黑素便增多，其活性降低，合成的黑素便減少。所以說酪氨酸酶為控制黑素細胞活性的物質，並影響產生黑素的快慢。

酪氨酸酶存在生物體內位置不一樣。一些真菌酪氨酸酶出現於細胞介質中，而多數真菌裡的酶出現於細胞內。真菌和細菌中的酪氨酸酶是作為可溶性化合物出現並不跟細胞膜接觸。植物酪氨酸酶正常情況下出現的地方有花冠、分生組織、葉片、塊莖、根。正常在幼嫩部位分佈較多，在成熟部味分佈較少且與膜緊緊相連［13-15］。在植物細胞葉綠體中的酪氨酸酶是不活潑的是比較穩定的，但是植物酪氨酸酶可以被很多東西活化例如一些脂肪酸與胰蛋白酶。光其實也能活化酪氨酸酶。原因是沒有另外化合物可活化植物酪氨酸酶的情況下，植物酪氨酸酶會由葉綠體膜上光合作用氧化活化。植物酪氨酸酶參加光合作用是以還原酶的形式調控胞質中的氧化還原水平，可同氧結合運載氧氣來控制葉綠體中的光和作用速率，參與反應電子傳遞起到了能量轉換作用［16-20］。

圖

1.3.

2

多酚氧化酶在植物細胞中合成黑色素的過程

植物酪氨酸酶參加花色的形成反應。Nakayama等人（2000-2001）在金魚草等的提取物中探究出了金魚草素合成酶，之後探究金魚草素合成酶和它的cDNA顯示其結構與多酚氧化酶相似性達到39%-51%，像是同一系列物質。該酶把查耳酮當做底物反應生為黃酮類化合物，由於黃酮為植物花朵變成黃色的主化合物，所以判定植物酪氨酸酶參於植物花朵顏色的形成。在衰老變褐變黑方面，暗褐色是由已存在底物與多酚氧化酶接觸來引起的，黑色是由液泡膜蛋白與酶的接觸引起的。植物受傷時，出現的醌類化合物是由多酚氧化酶與酚類化合物反應產生的，性質很活潑，質體的破壞導致多酚氧化酶的啟用和從液泡中釋放的酚類化合物相互作用，產生醌類化合物用於保護植物免受進一步傷害［15］。

1。4酪氨酸酶的應用

1。4。1酪氨酸酶在醫藥合成的應用

酪氨酸酶可以催化酚類物質的氧化例如催化單苯酚反應生成鄰苯二酚，繼而生成鄰苯醌：可以作為單酚酶羥基化單酚生成鄰二酚；也可作為雙酚酶氧化鄰二酚生成醌（機理［21］如圖1。4。1）。而其催化的物理環境條件也是，現在人們的研究方向［22，23］。

酪氨酸酶可參與肽的合成：實驗證實苯醯肼可以由酪氨酸酶催化下透過2步反應可以完成消除羧基保護基團的過程（機理如圖1。4。2）。由於該酶擁有良佳的專一性，不會與肽鍵反應也不會反應掉氮端的保護基團，過程不會產生劇烈影響，這一反應原理提煉技術可廣泛地應用於肽與脂、二元醇、二氧磷基團的聯結。

圖

1.4.1

酪氨酸酶催化酚類化合物機理

圖

1.4.2

酪氨酸酶去除基酸或肽的羧基保護基團的機理

在醫藥領域酪氨酸酶通常用來合成L型多巴左旋多巴（合成路徑如下圖［24］），是用來治療帕金森病的有效藥物同時還可用於治療腿多動綜合徵、肝昏迷、一氧化碳中毒、錳中毒精神病、心力衰竭潰長病、脫毛症等病狀。並會調節人性功能與防老化功能。也透過體外反應制成黑色素。可以用於醫藥治癒因少黑色素而產生的疾病例如：著色性幹皮病、帕金森氏症、老年痴呆症、亨延時舞蹈病等。據文獻記載，酪氨酸酶還可體外抗HIV病毒：可干擾HIV病毒誘導的合胞體的形成阻止病毒被膜表面糖蛋白和T特異細胞與淋巴細胞的結合［25］。

圖

1.4.3

酪氨酸酶催化酪氨酸合成L型多巴左旋多巴路徑

1。4。2酪氨酸酶在保護環境中的應用

眾所周知工業生活廢水中純在大量的芳香族化合物和酚類物質。酚類物質是會對生物產生毒性的，部分酚會使生物得癌症，作用在人、畜與農作物上會產生不利影響，所以解決人類生產留下的廢物中的酚類毒物是世界共同正視一個問題。生活廢水中的酚類毒物大都是使用煤、油、塑膠等後產生的。現在把廢水裡的酚毒物除掉的方法有溶劑萃取法、微生物降解法、活性炭吸附法與化學氧化法。利用化學氧化法和溶劑萃取的方法可能會發生二次汙染。微生物降解酚類化合物必須透過多量的培養基和大量的時間，而且由於酚的存在微生物死亡量會增多。20世紀80年代，科學家創新酶法來減少酚的不利影響，而利用酪氨酸酶解決酚毒物成為了最受歡迎的方法。酪氨酸酶把酚毒物與芳香胺類氧化反應得到醌，得到的醌再由多聚化反應生為難溶性的物體。再簡單過濾就能把難溶性化合物跟水物理分離；另外的辦法為透過酪氨酸酶的催化作用使酚跟丙酮酸鹽還有氨反應為L一酪氨酸，L一酪氨酸為難溶性物質，再透過物理過濾把它從廢水裡分離去，並手機到L一酪氨酸（酪氨酸酶與廢水中酚類胺類物質反應如下［26］）。

圖

1.4.4

酪氨酸酶與廢水中酚類物質反應過程

隨著工業發展，同時處理的酚量增多，酚的處理也實現了工業化。科學家發現了很多固定酪氨酸酶辦法，比如透過流化床固定化反應器、海藻酸鋁包埋酪氨酶、磁鐵固定化酪氨酸酶等方法。這些辦法使得酪氨酸酶可以不斷地對酚類物質進行處理，並且在儲存與運輸安全方面也提供了保障。

1。4。3酪氨酸酶可用於製備生物電極

生物電級是把酪氨酸酶固定在特質電極上，可以在生物感測器中使用。生物感測器能在很多雜亂體系中迅速地檢測出特定物質的含量，準確率極高並不受其他物質干擾。它是把酶的專一性、靈敏性有機的融合在一起。生物感測器中酪氨酸酶的分析作用最先由Macholan和Schanel報道，他們測了還原酚類物質中的氧。此後，酪氨酸酶感測器有酚類物質的監測引起了人們極大的關注。透過生物感測器中酪氨酸酶生物電級的特性可以擴充套件應用來檢查微量的苯酚、兒茶酚等酚類化合物。實驗證明酪氨酸酶與裸銀電極結合在緩衝液中會出現波峰並出現峰電位差。兩峰Epc=171mv和Epa=346mv與酪氛酸酶濃度在一定範圍內（1x10-9-5x10-8 mol/L）有良好線性關係，可用於測定酪氨酸酶的濃度。 用生物感測器測定酚類汙染物和酪氨酸酶濃度具有檢測限低、選擇性高、分析速度快、操作簡便等優點［26，27，28，29］。

1。5 酪氨酸酶的提純分析方法

1。5。1 酪氨酸酶的提取純化過程

1。5。1。1 細胞破碎

細胞破碎的處理方法通常分為化學處理法與物理處理法兩大類：化學處理法是利用化學試劑處理磨壞細胞膜，使細胞內的內溶物流出來。常用的溶解動細胞膜的化學物質有往氧膽酸鈉等。植物細胞壁通常用溶菌酶溶解。這種方法將引起細胞內蛋白質和核酸水解酶流出進入溶液中，會降解一些酶，引起酶產量下降並且活性較低，不宜實驗進行。

物理處理法例如勻漿研磨是指將適當溶媒加入到新鮮的生物組織中，在研缽中研杆（加入少量二氧化矽）的反覆研磨下，利用外力破壞細胞膜和細胞壁。細胞即破碎完全又不會影響酶活性。方法簡便，適合實驗室使用。

1。5。1。2酶的提取

細胞結構被破壞後就要對酶容液來簡單提取。傳統的提取方法勻漿法提取酶即利用勻漿研磨來破壞細胞結構之後細胞內容物包括目的產物等物質流出來，細胞液中的活性成分溶出進入到溶媒中再進行離心分離（方法如下）［28，29，30］。

在研缽中放入一定量的果蔬碎片，加入適量的緩衝溶液（常用PH=7左右的磷酸緩衝溶液）。充分研磨，用力擠壓用紗布過濾提取，提取液立即放入離心機在4℃下進行離心，倒出上層清液，上層清液保存於4℃冰箱中待用。這中方法簡單、經濟、實用，但是所提取的酶液中含有較多的酚類影響非的活性並且提取過程中會有大量的酶被氧化失活。所以此方法效率不高。下面對此法進行改進：向樣品中加入PVPP（聚乙烯吡咯烷酮）對多酚酶吸附從而減少酶與水氧的接觸氧化增加酪氨酸酶的活性時間［31，32，33］。改進後增加吸附劑方法與勻漿法相比多了PVPP，它的吸附作用能夠減少酪氨酸酶的氧化量。提高酶活力的方法還有勻漿後丙酮抽提，即利用冷的有機（丙酮）溶劑與蛋白質短時間接觸導致蛋白質沉澱（而不變性）的性質來沉澱蛋白質［34，35］。相比之下，丙酮抽提法方法所得總酶活力比較高，但兩者提取物多酚類殘留都較多影響酪氨酸酶的測定。為了減少酚類可用丙酮粉法。

丙酮粉法是指透過對酶的脫水保護酶不被水中其他物質破壞還可使其從難以分離的酚類物質中分離得到較純的多酚酶。取樣品加入冷凍的丙酮，用布氏漏斗加濾紙抽濾所得到的勻漿。用冷凍丙酮再將濾餅多次提取、直到顏色變淺或者無色，得粗酶粉末，在通風櫥中通風處理粉末，除去丙酮之後，乾粉溶於緩衝溶液中，攪拌，然後低溫離心，取上清液於4℃冰箱儲存備用。這種方法可以得到較純的酪氨酸酶。但是粉末酪氨酸酶需要再次溶解到溶液中，才能進一步實驗。

為防止溶解過程放生氧化可利用綜合勻漿法和丙酮粉法。可以先丙酮粉法再進行吸附，即丙酮粉法之後容解時再加入PVPP。這種方法制備的酶提取液的多酚類相對較少，總活力也比交大，酶的穩定性也相對較高。適合小型分析實驗［36，37］。

1。5。1。3 純化酪氨酸酶

為進一步純化酪氨酸酶可以利用層析技術進行提純。酪氨酸酶是大分子化合物可以利用凝膠層析法來分離提純。層析柱由多孔凝膠作為過濾層，由於不同大小的分子經過時被擋時停留時間也不一樣（參考方法如下）。從而分離得到較純的目標產物。

取粗酶液分別加入硫酸銨（降低酶的溶解度）至30%、40%、50%、 60%和70%的飽和度，置4℃下低速攪拌，離心，沉澱加入適量的PBS（磷酸緩衝溶液PH為7左右）充分溶解，於同樣的PBS透析12 h，在低溫離心，鹽析後上清液進一步純化。鹽析後將上清液加入DEAE Sepharose Fast Flow層析柱（預先用pH 7。5的PBS平衡），用 PBS淋洗3個柱體積，後用含 NaCl的PBS進行線性梯度洗脫，測定酶活力，收集有活性的部分，後用 PEG一20000進行濃縮。 DEAE Sepharose Fast Flow層析後濃縮酶液上Sephadex G一75柱（1。6 cm×50。O cm），用PBS清洗之後，檢測酶的活性對活性較高的部分放在一起濃縮即可。

此方法較上述幾種方法得到的酪氨酸酶的純度更高、活性更高，但是實驗室要求儀器配置高，收量少不夠經濟簡便。

1。5。2用分光光度計對植物酪氨酸酶進行活性分析（以果蔬實驗為例）

將酪氨酸酶提取液與鄰苯二酚溶液混合反應，再於分光光度計上進行掃描。取吸光度（A）最大時的吸收波長λ進行酶活性實驗。以A為縱座標，t為橫座標，計算機做圖計算線性斜率k，可得酶的活性。酶的活性單位定義在25℃時最佳化的條件下（PH，離子強度等）在一分鐘內轉化1umol底物所需要的量［38］。

測定原理：再有氧的情況下酪氨酸酶可以催化鄰苯二酚反應為鄰苯醌，可以透過計算酚生成醌的速度來判斷其活力大小。醌溶液在波長400-800nm有吸收，可用分光光度計間接測其活性。

1。5。3 利用酶標儀對動物細胞中酪氨酸酶活性的測定（以B16小鼠細胞為例）

定量培養一些動物細胞（通常以B16小鼠細胞實驗），提取細胞中蛋白並對其進行定量分析。透過用酶標儀測定多巴醌的生成量來判斷酪氨酸酶的活性。

測定原理：由於該酶可以把L—酪氨酸氧化為醌，紅色多巴醌有顏色容易觀察，醌在經過一系列反應生成混合黑素顯黑色（機理見圖1。2）。因為可以利用紫外分光光度計可以測到醌的吸收波長，可以利用測其活力來表示酶的活性。根據加藥組與空白對照組的比較計算酪氨酸酶的活性。

1。5。4人和一些高等動物體中酪氨酸酶活性的微量分析方法

在人和一些高等動物細胞內的苯丙氨酸可以反應為賴氨酸，透過賴氨酸酶的作用形成多巴，在經過一系列反應形成黑色素。我們可以透過直接測酪氨酸羥基化（酪氨酸形成多巴的過程）的活性，亦即測羥基化的酪氨酸量來表示酪氨酸酶活性［39，40］。

2實驗：分光光度法測果蔬中酪氨酸酶活性

2。1實驗材料：

水果碎塊（蘋果、葡萄、梨、香蕉） 鄰苯二酚（分析純） 磷酸氫二鈉（分析純）碳酸鈉（分析純）

2。2實驗儀器：

721分光光度計 離心機 秒錶 電子天平 水浴鍋

2。3實驗原理：

鄰苯二酚在酶和氧存在條件下可迅速轉變成鄰苯醌，在一定波長下有吸收，因此，可以透過測定鄰苯二酚轉變成鄰苯醌的速率來表示酶活性。

2。4酶活性的計算：

酶的活性單位定義在25℃時最佳化的條件下（PH，離子強度等）在一分鐘內轉化1umol底物所需要的量：

T=△A/εtV×106

（T：所用溶液的酶的活性；△A：最大吸收處吸光度的變化；ε：鄰苯二酚的摩爾吸收係數；t：反應時間；V：加入的酶體積）

原料酶活性A：

A= TV0/m

（T：所用溶液的酶的活性；V0：原料所得的酶溶液的總體積；m：原料總質量）

2。5酶的提取

用電子天平稱取1500g的水果碎塊，分開依次放入研缽中，加入少量緩衝溶液，充分研磨，再透過過濾紗布過濾出提取液，將提取液放入離心機中進行離心，設定機器的轉速為35000r mp所用時間是30分左右。倒出上清液，加入催化劑（金屬離子等）500g，混合均勻並加入10L的容器中，再加水至10L。密封保存於陰涼處。

2。6測吸收光譜

取0。5mL水果提取液 ，加入0。5mL的鄰苯二酚溶液和4mLpH=7。2的緩衝溶液，反覆搖勻，反應15min，在將溶液移入比色皿中，將比色皿放入分光光度計中進行實驗掃描得到在現實最大值為0。628，此時的吸收波長為415nm。

2。7酶活性的測定

取10mL比色管，加入2。5ml的提取液並且同時加入pH=7。2的緩衝溶液稀釋。分別取0。1mL、0。2mL、0。3mL、0。4mL稀釋過的提取液加入10mL的比色管中，對應加入2。9-2。6mL的緩衝溶液，接著加進鄰苯二酚溶液2mL，保證總體積為5毫升，同時用分光光度計側波長415nm處的吸光度。同時計時，測量10分鐘，每一分鐘讀一次數，直到吸光度值逐漸穩定。

2。8 PH對酶活性的影響

取0。2mL已稀釋過的提取液於10mL比色管中，分別加入2。8mLPH=6。0、6。3、6。7、7。2、7。5的緩衝溶液，再加入2mL的鄰二苯酚。分別在分光光度計415nm波長下測其吸光度。利用酶活性對PH作圖觀察PH對酶活性的影響。

2。9溫度對酶活性的影響

取0。2mL已稀釋過的酶溶液於10mL的比色管中，再加入2。8mLpH=7。2的緩衝溶液，分別在溫度為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中預熱10分鐘，再加入2mL的鄰苯二酚。並開始計時測溶液的吸光度。以酶活性對溫度作圖可得到溫度對其影響。

2。10無機鹽對酶活性的影響

取0。2mL已稀釋過的酶溶液於10mL的比色管中，再加入2。8mL pH=7。2的緩衝溶液，一組加入少量NaCO3溶液，另一組不加NaCO3溶液，再加入鄰苯二酚。並開始計時測溶液的吸光度。對結果進行比較。

3資料與分析

3。1酶活性的測定

表

1 不同時間下測得的吸光度值

（表1：t為反應時間；A1、A2、A3、A4分別為0。1、0。2、0。3、0。4mL稀釋提取液在415nm波長下的吸光度）

圖3.1 吸光度對應時間的散點圖

圖3.2 散點圖變化部分的斜率

A1、A2、A3、A4對時間t作圖圖線，斜線為對應的切線，其斜率分別為：k1=0。06；k2=0。1189；k3=0。1743；k4=0。2251

將k值帶入上述公式可分別得到不同體積提取液的活性：

表2 將k帶入方程計算所得酶活性值

由表中資料可知隨著提取液的體積的增加，酶的活性逐漸增加，而原料酶活性卻有所減小。

3。2不同PH對酶活性的影響

對不同PH環境下的酶提取液活性進性計算，計算過程同上，所得的計算結果如下表，並對其變化做趨勢圖如下：

表3 不同PH條件下測定酶的活性值

圖3.3 不同PH對應酶活性曲線圖

由圖可看出酶活性隨著PH值的增大而增大在PH=7左右時有最大值，之後酶活性又逐漸下降。可以得到結論酪氨酸酶的合適環境PH為中性，酸性、鹼性環境下都活降低酪氨酸酶的活性。

3。3不同溫度對酶活性的影響

對不同溫度下酪氨酸酶的活性進性計算，所得結果如下表：

表4 不同溫度下測得的酶活性值

以酶活性對溫度的變化趨勢作圖如下：

圖3.3 不同溫度對應酶活性曲線

由圖可以看出在一定範圍內隨著溫度的升高酶活性逐漸增大，在30℃左右時有最大值。當溫度繼續升高是酶活性急劇下降，到70℃時酶基本永久性失活。

3。4無機鹽對酶活性的影響

對實驗中提取的酶溶液分別加入和不加無機鹽得到其活性如下表：

表5 加入無機鹽對應酶活性

由表可以看出加入無機鹽會使酶失活，可見無機鹽對酶的影響非常大。

結論

利用分光光度計測酪氨酸酶活性，根據測量不同時間下的吸光度並作圖求出斜率，進而代表酶的活性，再透過公式計算出提取液的酶的活性與原料中的酶的活性。由活性可以看到隨著提取液體積的增加原提取液酶活性也對應增加，而原料活性值減少。這將為探究影響酶活性因素提供對照。再透過在不同溫度、PH環境下測酶活性來分析其影響因素得出結論：酶在30℃左右酸鹼度為中性的環境下有最大的活性值，無機鹽對酶的影響是永久性失活所以酶在儲運時應避免與無機鹽接觸。由於基因的多樣性人們對酪氨酸酶表達環境的研究始終具交大的侷限性，生物體內酪氨酸酶會與各中生物酶或者其他化學物質在各時間段在不同的表達環境內相互作用進一步會產生不同的作用。所以對它的研究方法是個值得深究的問題。

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致謝

轉眼之間，四年的大學時光就要結束了，四年來，伴隨著歡笑，喜悅，知識與友誼不斷前行，這些離不開身邊的人的照顧，感謝那些幫助我的朋友、同學和老師。

本論文是在劉姝老師的親切關懷和精心指導下完成的。從論文的選題、設計以及最後論文的完成都傾注了老師的心血。幾個月來，老師對我細心指導，積極鼓勵，在各個方面都給予了我極大的支援和幫助，並提供了優越的學習和研究條件，使得本文能夠順利的完成。我所取得的成果與老師的耐心指導是分不開的，每一次實驗老師都會盡自己最大的可能幫助我，為我解決實驗中遇到的各種難題，老師淵博的知識、嚴謹的治學態度，塌實認真的工作作風，謙虛謹慎的品格，使我受益非淺。在此，我表示由衷的敬意和感謝！

另外，我還要特別感謝我的同學丁子洋、陳熙鵬，感謝她們對我一直以來的支援、照顧，感謝我的家人多年來對我的無微不至的關心，在此向她們的辛苦付出表示最誠摯的謝意！

在此由衷的感謝我的親人、老師、同學及朋友，謝謝！