FFPE樣本和新鮮樣本全轉錄組測序腎上腺皮質腫瘤RNA表達相似？

據估計，全世界的醫院和組織庫中大概有四億到十億份FFPE樣本。對於某些型別的腫瘤組織，FFPE樣品通常是核酸的來源，這些樣本可以為研究人員提供有關某些罕見的癌症和其他疾病的重要資訊。利用FFPE樣本進行DNA高通量測序已經是常規技術（全外顯子測序和重測序），且已經產生了大量資料。而使用FFPE樣本開展轉錄組水平的測序工作報道相對比較少。

今年3月，

Frontiers in Endocrinology

(IF:6.055)

發表的一篇文章評估了腎上腺皮質腫瘤FFPE樣本可以進行

全轉錄組測序

的效果。從本文結果來看，FFPE樣本是可以用來進行RNA抽提和建庫測序，且其資料結果與新鮮凍存樣本的資料結果差異不大。

一、樣本：

1、腎上腺皮質癌樣本（ACC）新鮮凍存和FFPE樣本各3份；

2、產生醛固酮的腺瘤（APA）新鮮凍存和FFPE樣本各3份；

3、皮質醇生成腺瘤（CPA）新鮮凍存和FFPE樣本各3份。

二、材料與方法

1、RNA抽提質檢：

（1）新鮮凍存樣本使用Trizol抽提RNA，FFPE樣本使用Promega的Maxwell RSC RNA FFPE kit抽提RNA。

（2）RNA質檢使用Bioanalyzer 2100， RNA質量的判定使用RIN值和DV200兩項指標。

2、建庫：

使用NEBNext rRNA去除試劑盒及NEBNext Ultra II Direcational RNA建庫試劑盒。

三、結果分析

1、RNA抽提分析

與新鮮凍存的樣本相比，FFPE樣本的RNA抽提得率、RIN值和DV值均偏低（圖1）。FFPE樣本的RNA濃度平均值為36ng/μL， RIN值平均值僅為2。2， DV200平均值為47。6%；而新鮮凍存樣本的RNA濃度為464。5ng/μL， RIN值平均值為7。9，DV200平均值為71%。將FFPE樣本分成存放時間大於340天小於340天兩組，新鮮凍存樣本分成存放時間大於427天和小於427天，分別對RNA濃度、RIN值和DV200進行統計發現，無論是FFPE樣本還是冷凍樣本存放時長對RNA的得率、RIN值和DV200均無明顯影響。

圖1 | FFPE與新鮮凍存樣本RNA質控統計

2、RNA測序資料分析結果

（1）FFPE樣本與新鮮凍存樣本RNA分別建庫測序，得到的原始資料相近，分別為33M reads和32。9M reads

。

但是兩者的基因組比對率差異較大，其中FFPE樣本的基因組比對率為82。9%，而凍存樣本的基因組為 87。7%。因此FFPE樣本所得到的可用於分析的reads數明顯少於凍存樣本。但是二者分析得到的基因數並無明顯差別，平均值分別為18160 和 18001。

圖2 | FFPE樣本和新鮮凍存樣本可分析reads數和鑑定到的基因數

（2）用標準化後的測序資料進行各組樣本的相關性分析發現，FFPE樣本與新鮮凍存樣本資料的相關性的平均值為0。93（圖3），而且採用FFPE樣本所得到的基因表達結果與新鮮凍存樣本的表達結果相似，但是可檢測的轉錄本數少於新鮮凍存細胞。

圖3 | FFPE樣本與新鮮凍存樣本測序資料的相關性

（3）為確認FFPE樣本的

轉錄組測序

結果是否能夠用於區分ACC、APA和CPA樣本，首先評估了新鮮凍存樣本的轉錄組測序資料是否能夠區分上述三種癌症，結果表明新鮮凍存樣本可以較好的對三種癌症進行區分，而對FFPE樣本的測序資料結果進行分析後發現，FFPE樣本所得到的結果與新鮮凍存樣本結果一致（圖4）。

圖4| 聚類分析結果

（4）對比同組的FFPE樣本和新鮮凍存樣本的基因表達情況，ACC組的FFPE樣本中有402個差異基因，其中161個上調，241個下調。在ACC組的新鮮凍存樣本中則有356個差異表達基因，其中148個上調，208個下調，兩者的共有基因為193個，其中76個上調，117個下調。

對APA和CPA的FFPE樣本和新鮮凍存樣本分別進行分析，結果表明FFPE樣本產生的資料能夠用來鑑定APA和CPA特異基因。

四、結論

1、FFPE樣本能夠用來抽提RNA並進行

轉錄組建庫測序

；

2、FFPE樣本抽提RNA得率、RIN值及DV200與新鮮凍存樣本有較大差異；

3、在腎上腺皮質腫瘤中可以使用FFPE樣本替代新鮮凍存樣本進行疾病marker基因的鑑定；

4、在腎上腺皮質腫瘤的FFPE樣本的RNA表達模式與新鮮凍存樣本的RNA表達模式高度相似；

5、FFEP樣本能夠進行組織形態觀察，從而使顯微切割獲得特定部位的組織和細胞成為可能；

6、本篇文章的缺點是沒有能夠取到儲存年限更長的樣本進行研究。

7、本篇文章為大量的FFPE樣本的使用挖掘提供了新思路。

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