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Cell質譜流式單細胞蛋白組構建人乳腺癌腫瘤及免疫生態系統的圖譜

由鹿明生物多組學服務發表于藝術2023-01-30

簡介腫瘤相關免疫細胞之間的關係分析顯示，T-regs 和 PD-L1TAM 表型與 PD-1高CTLA-4 CD38 的 T 細胞表型相關，表明免疫抑制相互作用（圖 6 C）

個人生態系統圖怎麼畫

前言

乳腺癌

是全球女性癌症死亡的主要原因，對乳腺癌生態系統的瞭解是實施精準醫學的基礎。單細胞基因組和轉錄組為乳腺癌的分析提供了腫瘤內基因組多樣性和腫瘤間克隆組成差異的見解，但分析的細胞和腫瘤很少。鑑於乳腺癌細胞表型和細胞關係的異質性，患者分類和治療應考慮整個腫瘤生態系統。

單細胞轉錄組測序研究

為乳腺癌免疫細胞表型多樣性和生態系統的進一步探索提供了可能，為探究大型患者佇列的研究奠定了基礎。因此研究者應用

單細胞測序流式細胞儀

對來自 144 個人類乳腺腫瘤樣本的數百萬個細胞進行分析，闡明瞭乳腺癌生態系統中的表型多樣性和腫瘤免疫細胞關係。該單細胞圖譜為基於乳腺癌生態系統的患者分類奠定了基礎。

由蘇黎世大學

Bernd Bodenmiller

教授課題組在

Cell

期刊（IF：66。850）發表了題為

“A Single-Cell Atlas of the Tumor and Immune Ecosystem of Human Breast Cancer ”

的研究成果，透過

單細胞轉錄組、單細胞蛋白組，質譜流式

等研究技術，描繪了免疫生態系統的單細胞圖譜。為腫瘤治療及其免疫環境的精準醫學發展提供了理論依據。

研究思路

研究內容

1. 研究材料

144 個腫瘤樣本、46 個近腫瘤樣本和來自四個縮小乳房成形術的組織的 2600 萬個細胞

2.研究方法

組織準備：手術切除後，新鮮組織樣本立即轉移到預冷的 MACS 組織儲存溶液

抗體和抗體標記

抗體染色和細胞體積定量

免疫熒光成像

量化和統計分析

研究結果

1.乳腺癌生態系統的單細胞蛋白質組圖譜

研究者對 144 個腫瘤樣本進行了大規模

單細胞蛋白質組

分析，包括54 個luminal A，71個luminal B，6個 luminal B-HER2，1個HER2，和6個TN 腫瘤。組織病理學將樣本分為 106 個浸潤性導管、15 個浸潤性小葉和 19 個混合或其他腫瘤。使用自動化系統從所有組織樣本中生成單細胞懸浮液，新增標籤後用於抗體染色，並同時透過質譜流式細胞儀進行分析（圖 1 A 和S1 A）。分析產生了2600 萬個單細胞圖譜，每個樣本平均有 84。7% 的活細胞、非凋亡細胞（圖 S1B 和 S1C）。

為了確保高質量的資料，研究者確認了跨條形碼板的重複樣本的標記表達以及跨抗體組的活細胞和免疫細胞頻率的相似性（圖 S1 D 和 S1E）。

圖S1 | 乳腺癌單細胞圖譜的細胞型別鑑定

為了視覺化腫瘤和非腫瘤細胞的多樣性，作者使用降維演算法 t 分佈隨機鄰域嵌入生成了二維圖。大多數細胞是上皮細胞或免疫細胞，內皮細胞和成纖維細胞的丰度較低（圖 1B）。額外的成纖維細胞亞群和脂肪細胞可能在被描述為“其他”的細胞中（圖1C）。為了比較腫瘤和非腫瘤組織之間的細胞型別頻率，作者應用 PhenoGraph 演算法，將資料劃分為 42 個簇（圖 S1 M 和 S1N）。與非腫瘤組織相比，乳腺腫瘤富含上皮細胞，並且含有更少的內皮細胞和成纖維細胞（圖1D）。FAP+SMA+成纖維細胞在腫瘤中比在近腫瘤組織中更豐富（圖 S1 O 和 S1P）。細胞型別頻率在腫瘤亞型之間和之間有所不同，在 TN 和 HER2 +樣本中觀察到的免疫細胞頻率高於其他乳腺癌型別（圖 1 E 和S1 P）。

2.乳腺癌的免疫狀況

T細胞和髓細胞是我們研究中最豐富的免疫細胞型別；較少檢測到自然殺傷細胞（NK）、B細胞、粒細胞、漿細胞、嗜鹼性細胞和漿細胞樣樹突狀細胞（圖2A和S2A S2D）。乳腺腫瘤富含T細胞和B細胞，與腫瘤旁組織相比，含有較低頻率的NK細胞和粒細胞（圖2A）。如前所述，腫瘤相關免疫細胞頻率在患者間存在顯著差異（圖2A）。

圖2 | 乳腺癌的免疫狀況

T 細胞和巨噬細胞可以發揮促腫瘤或抗腫瘤活性，透過 t-SNE 和 PhenoGraph 對 T 細胞的深入分析確定了十個 CD4和十個 CD8 T 細胞簇（T01-T20；圖 2 B-2D）。大多數 T 細胞簇具有效應記憶表型（CD197low， CD45RAlow），腫瘤相關 T 細胞作為表型連續體存在於 CD4和 CD8譜系中（圖 2 D 和S2 E）。CD4 T 細胞中 PD-1 的平均表達水平高於CD8 T 細胞（圖 2 F）。PD-1 的平均表達水平和 PD-1 T 細胞頻率在 CD4 和 CD8 +隔室中相關，支援這些細胞由 T 細胞擴增產生的假設。

此外，研究者觀察到 ER 和 ER腫瘤的 T 細胞狀況的差異，包括 ER疾病中更高頻率的 T-regs （圖2H）。在超過一半的 ER腫瘤但只有 12% 的 ER 腫瘤中，超過 10% 的 T 細胞表達 PD-1（圖 S2 G）。不同的 PD-1表型分別富集：PD-1highCTLA-4 CD38 T 細胞在 ER腫瘤中更常見，而 PD-1 CTLA-4 - CD38 - T 細胞（T14）在 ER +腫瘤中富集（圖2H）。然而，許多 ER腫瘤確實顯示 PD-1高CTLA-4 CD38 T 細胞和 T-reg 的頻率與 ER 腫瘤相當或更高（圖2H）。

圖S2 | 乳腺腫瘤和非腫瘤組織中的免疫細胞表型分析

ER 腫瘤可根據低增殖和高增殖分別分為luminal A和luminal B。超過 10% 的 T 細胞在 18% 的 luminal B 腫瘤中表達 PD-1，但只有 7% 的 luminal A 腫瘤（圖 S2 H）。PD-1 int CTLA-4 - CD38 - T 細胞（T07）在 luminal A 疾病中更常見，而 T-regs 在 luminal B 腫瘤中富集（圖 2 I）。作者還在不同級別的腫瘤中觀察到不同的 T 細胞景觀。在 28% 的 3 級腫瘤、9% 的 2 級腫瘤和 10% 的 1 級腫瘤中， PD-1 T 細胞佔 T 細胞的 10% 以上（圖 S2 I）。3級腫瘤具有更多的PD-1高CTLA-4 CD38 T 細胞（T09 和 T11）和更少的 PD-1 int CTLA-4 CD38 T 細胞（T07 和 T14）比低級別腫瘤（圖 S2 J）。這表明免疫抑制的 T 細胞景觀與預後不良的腫瘤有關，包括 ER、高增殖和高級別腫瘤，但也在一部分 ER 腫瘤中觀察到。

3.乳腺腫瘤富含免疫抑制性巨噬細胞表型

為了表徵TAM群體，將 t-SNE 和 PhenoGraph 應用於所有骨髓細胞（圖 2 J 和S2 D），產生五類 19 個骨髓簇（M01-M19）。與近腫瘤組織相比，腫瘤富含 TAM，缺乏組織駐留巨噬細胞（M08 和 M09）、經典迴圈（M06）和促炎（M15）單核細胞（圖2M）。TAM 的浸潤與侵襲性疾病有關。

與 ER腫瘤相比， ER腫瘤包含更高頻率的 M01 和 M17 PD-L1 TAM，具有 M04、M05、M10 或 M12 表型的骨髓細胞更少（圖 2 N）。一部分 ER +腫瘤具有 M01 和 M02 PD-L1 TAM，其頻率與 ER腫瘤相當或更高（圖 2 N 和S2 L）。與 Luminal A 腫瘤相比，Luminal B 腫瘤含有更多具有 M07 或 M17 表型的髓細胞，較少具有 M04 表型，以及更多的 PD-L1 TAM。圖 2 O 和S2 M）。與 2 級腫瘤相比，PD-L1 TAM 在 3 級腫瘤中富集（圖 S2 N）。與低級別腫瘤相比，3 級腫瘤包含更少的具有 M04 或 M05 表型的細胞，但更多的經典單核細胞（M06）（圖 S2 O）。

4.腫瘤上皮細胞異質性和表型異常

對來自腫瘤和非腫瘤組織的上皮細胞的分析（STAR 方法）揭示了上皮標誌物的雙峰和梯度樣表達，表明許多不同的細胞表型（圖3A和3B ）。在 PhenoGraph 中實施的共識聚類方法（圖 S3 A；STAR 方法）揭示了 45 個上皮細胞簇（Ep01-Ep45）。層次聚類根據標記表達將它們分為七個管腔組 L1-L7 和兩個基礎組 B1 和 B2（圖 3 C、S3 B 和 S3C）。

圖3 | 乳腺癌腫瘤細胞表型研究

研究者根據

譜系標記表達模式

鑑定了乳房成形術和近腫瘤組織中的管腔和肌上皮細胞（圖 3 C、3D 和S3 D）。乳腺上皮細胞系證實了這些模式的可靠性（圖 3 E）。鑑定了增殖的（Ki-67 ）非腫瘤管腔細胞（圖 S3 E）。大約 55% 的腫瘤衍生細胞是 L1 和 L2 組的成員，這表明腫瘤樣本中富含分化的正常樣管腔細胞。L3-L7 組以腫瘤細胞為主（圖 3C）。L3 組表型顯示高水平的 EpCAM 和 CD49f 和低 ERα 表達（圖 3 C 和S3 D-S3F），這是腔內祖細胞的特徵。L4 組表型顯示出高水平的激素受體ERα、孕酮受體 B （PRB）和AR，以及受體酪氨酸激酶HER2、EGFR和肝細胞生長因子受體（c-MET）（圖 3 C 和S3 F）。這些受體與 ERα 或 HER2 的共表達可以賦予抗 ERα 和抗 HER2 治療的抗性。缺乏 ERα 和 HER2 與抗 ERα 和抗 HER2 治療的抗性有關。Ki-67 luminal 腫瘤細胞在所有 luminal 簇組中均發現，並且在 L7 組中最常見（圖 S3 G）。

圖S3 | 乳腺腫瘤細胞表型的深入分析

此外，L1-L7 組表型在腫瘤亞型中的分佈不同。與 HER2 +和 TN 腫瘤相比，L1 組和 L2 組表型指示成熟的管腔細胞和 L4 組和 L5 組強烈表達 ERα 的表型在管腔 A 和 B 腫瘤中更常見（圖3F）。增殖組 L7 表型常見於幾個 luminal B 腫瘤、幾個 luminal A 腫瘤和一個 TN 腫瘤。Luminal B-HER2 和 HER2 腫瘤含有來自 L3 和 L6 組的細胞（圖3F）。與鄰近的非腫瘤組織相比，許多管腔腫瘤含有更少的 K7 和更多的 K8和 K18細胞（圖 S3H），表明可能由上調的PI3K和 AKT 訊號傳導誘導的細胞角蛋白轉換。

5.表型異常和腫瘤個體性與預後不良的特徵

隨後，建立了三個計算分數來量化腫瘤異質性的不同方面（圖 4A）。表型異常描述了腫瘤細胞表型偏離非腫瘤上皮細胞的程度。腫瘤個體性根據細胞表型量化腫瘤的相似性。腫瘤豐富度表示生態系統內不同共存腫瘤細胞表型的數量。

圖4 | 分子表型異常和腫瘤個體性與預後不良的特徵

為了描述異常表型，利用自動編碼器識別非腫瘤上皮細胞表型並計算每個腫瘤細胞的均方誤差（MSE）（圖 S4 A）。結果顯示，在上皮簇組 L6、L7、B1 和 B2 中檢測到最異常的腫瘤細胞（圖4B）。與富含來自 L1 和 L2 組細胞的腫瘤相比，主要包含來自這些簇的細胞的腫瘤更多地偏離近腫瘤組織（圖 4 C-4E）。表型異常細胞在高級別腫瘤、大多數 ER 腫瘤、一部分 ER腫瘤和預後不良的亞型腫瘤中富集（圖 4F-4H）。表型異常與缺氧和增殖標誌物表達相關（圖 4 I），反映了腫瘤生態系統內的異常生長條件。與 4% 的 CA9腫瘤細胞相比，約 25% 的 CA9腫瘤細胞表現出 EMT 表型。佇列中的一些近腫瘤組織樣本包含表型異常細胞和高頻率的 CA9或 Ki-67細胞（圖 S4 B 和 S4C；表 S5 ），可能代表原位癌前病變導管癌的區域。

圖S4 | 腫瘤和非腫瘤組織樣本的表型異常和個體性

為了評估腫瘤生態系統的個體性，對所有樣本的上皮細胞資料應用了基於圖表的方法（圖 4 A）。個體性得分表明樣本的細胞是否更類似於同一樣本的細胞或其他樣本的細胞（圖 S4 D）。腫瘤顯示出比近腫瘤組織更高的個體評分（圖 4 J）。重要的是，腫瘤個體性與表型異常相關（圖4K），這表明腫瘤細胞與非腫瘤細胞的表型偏離越多，它們在不同患者的腫瘤中發現的可能性就越小（圖 S4D）。腫瘤個體性在高級別腫瘤和 luminal B、luminal B-HER2或 TN 亞型腫瘤中更為突出（圖 S4 E）。ER 腫瘤的個體差異很大，並且與 ERα 細胞的百分比相關（圖 4 L 和 4M）。未檢測到個體與侵襲淋巴結或遠處轉移之間的關聯（圖S4 F）。

為了探索腫瘤豐富度（圖 4A），計算了每個樣本的每個上皮細胞簇的頻率，並報告了 1% 以上的簇數。所有腫瘤和非腫瘤樣本都包含來自多個簇的細胞（圖 4 N）。值得注意的是，與非腫瘤組織相比，大多數腫瘤的豐富度沒有增加，並且腫瘤豐富度與個體性反相關（圖4O 和 4P）。在 43% 的腫瘤樣本（144 箇中的 62 個）中，至少 50% 的腫瘤所有細胞屬於一個簇，這可能反映了不同癌細胞克隆的擴增（圖 4N）。在 58% 的 3 級腫瘤、33% 的 2 級腫瘤和 35% 的 1 級腫瘤中觀察到這種叢集優勢。在 51% 的 luminal B、50% 的 luminal B-HER2和 67% 的 TN 腫瘤中觀察到簇優勢，但在 luminal A 腫瘤中僅佔 29%。在 45 個上皮細胞簇中，37 個簇（82%）佔一個或多個腫瘤中所有細胞的至少 50%（圖 4 N）。七個優勢簇是腫瘤特異性的，四個顯示出高表型異常（圖 4 B 和S4 G）。

對佇列中的 10 個腫瘤進行的分析，儘管新輔助化療並未顯著消退，但揭示了個體表型組成，表明不同的腫瘤細胞表型在治療中存活（圖 4 Q）。這些包括具有 ERα HER2表型和 ERα HER2表型的高度異常腫瘤細胞（圖 4B 和 4Q）。從其他四名患者那裡收集了同一腫瘤的兩個不同區域。在三個案例中，在兩個區域都觀察到了相似的表型組成。在第四個腫瘤中，優勢克隆存在於兩個區域，但頻率不同，一個區域的增殖特徵（5% Ki-67）比另一個區域（0。6% Ki-67）更具增殖性（圖 S4 H）。

6.基於腫瘤生態系統的分類揭示了不同的組和多個腫瘤單例

層次聚類生成的熱圖顯示三組包含許多腫瘤、四組包含三個或四個腫瘤、36 個腫瘤單例和三組非腫瘤樣本（圖 5）。主成分分析確定瞭解釋不同組之間最高變異性的叢集。此外，Tu1-Tu7 組的臨床亞型和分級存在異質性（圖 S5 A 和 S5B）。

圖5 | 腫瘤生態系統中的關係與疾病進展的特徵

在 N2 組中發現了所有乳房成形術樣本和 54% 的近腫瘤樣本，表明生態系統密切相關（圖 5A）。與非腫瘤組織相似，在 N2 組中發現的五個腫瘤主要包含 L1 和 L2 組上皮表型、迴圈 T 細胞（T16）和組織駐留巨噬細胞（M08）（圖 5A ）。所有 5 個腫瘤均為 luminal A 亞型和低級別，這表明腫瘤在表型上與非腫瘤組織相似，或者這些樣本中的腫瘤含量特別低。腫瘤單例通常不共享腫瘤細胞表型，反映了高腫瘤個體性，並且比 Tu1 和 Tu3 組的腫瘤具有更高的表型異常評分和更多的增殖細胞（圖 5 C-5E）。Luminal B-HER2 、HER2和 TN 腫瘤要麼是小腫瘤組的一部分，要麼是單個腫瘤（圖 5A）。因此，腫瘤上皮及其免疫環境中的模式都包含腫瘤分層資訊。

7.乳腺腫瘤及其免疫環境是相互交織的實體，兩者對於分類都很重要

腫瘤細胞和腫瘤-宿主細胞相互作用的網路推動著疾病進展，是藥物干預有希望的目標。為了系統地闡明同型和異型腫瘤與免疫細胞的關係，對所有樣品中所有細胞表型簇的頻率進行了成對 Spearman 相關分析（圖 6A -6C；表 S5）。在來自不同簇組的表型之間發現了同型上皮細胞關係（圖6A）。非腫瘤管腔表型如 Ep30 和 Ep31（L1 組）是相關的，而腫瘤特異性表型通常分別富集，反映表型優勢和腫瘤個體性（圖 6A ）。L1 和 L2 組以及 Ep39 簇中非腫瘤表型的頻率與這些免疫抑制表型呈負相關（圖6B ），但與 PD-1 CTLA-4 CD38 表型 T07 和 T18 相關（圖 6 B）。腫瘤相關免疫細胞之間的關係分析顯示，T-regs 和 PD-L1 TAM 表型與 PD-1高CTLA-4 CD38 的 T 細胞表型相關，表明免疫抑制相互作用（圖 6 C）。T-regs 和 PD-L1 TAM 沒有或僅與 PD-1 CTLA-4 CD38 T 細胞表型負相關（圖 6 C）。

此外，免疫抑制模式與腫瘤表型異常和個體評分、缺氧和增殖相關（圖6D）。免疫抑制性 TAM 和 T 細胞與 ERα 細胞丰度之間的相關性（圖 6 D），表明雌激素訊號傳導是腫瘤生態系統中的塑造力量。