張鋒團隊新進展｜利用人類蛋白質向細胞靶向提供分子藥物

編輯 | 蘿蔔皮

在醫療領域，靶向分子療法、細胞療法以及基因治療會受宿主基體的免疫排斥反應影響，治療效果往往大打折扣。

科學家發現，其中一種逆轉錄病毒樣蛋白 PEG10 可以直接與細胞外病毒樣衣殼結合，並分泌其自身的 mRNA。

來自麻省理工學院張鋒團隊的

研究人員，開發了一種向細胞提供分子療法的新方法。

該系統稱為 SEND，可以透過程式設計來封裝，並遞送不同的「RNA 貨物」；SEND 利用體內的天然蛋白質，形成病毒樣顆粒並結合 RNA；與其他遞送方法相比，它引發的免疫反應可能較少。

該研究以「

Mammalian retrovirus-like protein PEG10 packages its own mRNA and can be pseudotyped for mRNA delivery

」為題，於 2021 年 8 月 20 日釋出在《Science》。

在生物進化過程中，逆轉錄病毒和逆轉錄元件已將其遺傳密碼插入哺乳動物基因組中。

儘管這些整合的病毒樣序列對基因組完整性構成威脅，但也有一些些已被哺乳動物細胞重組，同時在發育中發揮重要作用。

真核基因組包含來自整合病毒和移動遺傳元件的馴化基因。

其中包括長末端重複 （LTR） 逆轉錄轉座子和逆轉錄病毒的衣殼蛋白（稱為 Gag）的同源物。

研究人員確定了幾種哺乳動物 Gag 同源物，它們形成病毒樣顆粒和一種 LTR 逆轉錄轉座子同源物 PEG10，它優先結合並促進其自身信使 RNA （mRNA） 的囊泡分泌。

研究表明，PEG10 的 mRNA 貨物可以透過將感興趣的基因與

Peg10

的非翻譯區側翼進行重程式設計。利用這種可重程式設計性，研究人員透過設計小鼠和人類 PEG10 來包裝、分泌和遞送特定的 RNA，開發了用於細胞遞送 （SEND） 的選擇性內源性衣殼化。總之，這些結果表明 SEND 是一個模組化平臺，適合開發為一種有效的治療傳遞方式。

SEND 的中心是一種稱為 PEG10 的蛋白質，它通常與其自身的 mRNA 結合，並在其周圍形成一個球形保護膠囊。研究中，該團隊透過設計 PEG10，從而實現選擇性地包裝和遞送其他 RNA。科學家們使用 SEND 將 CRISPR-Cas9 基因編輯系統傳遞給小鼠和人類細胞，以編輯目標基因。

哺乳動物細胞形成 Gag 同源物的計算篩選

為了鑑定具有轉移特定核酸潛力的基因，研究人員專注於包含核心衣殼 （CA） 結構域的 Gag 同源物，該結構域保護逆轉錄轉座子和外源逆轉錄病毒的基因組。基因組分析確定了哺乳動物基因組中的許多內源性 Gag 同源物，形成分泌在細胞外囊泡內的衣殼樣顆粒（EVs）。

圖示：鑑定形成衣殼並被分泌的哺乳動物逆轉錄元件衍生的 Gag 同源物。（來源：論文）

MmPEG10 結合並分泌其自身的 mRNA

為了確定這些蛋白質是否在 EV 內分泌，研究人員在人胚胎腎（HEK）293 FT 細胞中過表達每個含 CA 基因的表位標記小鼠直向同源物，並收集全細胞裂解物和病毒樣顆粒（VLP）透過培養基的澄清和超速離心分離部分。

圖示：MmPEG10 蛋白和 mRNA 在體外由細胞分泌到囊泡中。（來源：論文）

結果表明，MmMOAP1、MmArc、MmPEG10 和 MmRTL1 都存在於 VLP 級分中，但 MmPEG10 是 VLP 級分中最豐富的蛋白質。此外，內源性 MmPEG10，很容易在無細胞成年小鼠血清中檢測到。

接下來，研究人員使用 RNA 測序測試了由 Gag 同源物形成的任何衣殼樣顆粒是否包含特定的 mRNA。發現 MmPeg10 轉錄啟用導致可觀數量的全- VLP 部分中的長度 MmPeg10 mRNA 轉錄本。

圖示：帶有 MmPeg10 5 和 3 UTR 的側翼 mRNA 能夠將 mRNA 功能性地細胞間轉移到靶細胞中。（來源：論文）

PEG10 是一個進行 RNA 傳遞的模組化平臺

為了生成完全內源性的 SEND 系統，研究人員測試了 VSVg 是否可以被內源性融合跨膜蛋白替代。鑑於 MmPeg10/HsPEG10 和合胞素基因的重疊組織表達，還測試了用 MmSYNA 或 MmSYNB 對小鼠 SEND 系統進行假型與使用 VSVg 進行假型的可行性。結果表明，這種細胞型別適合透過這些融合素進行轉導。

研究人員將轉導增強劑 vectofusin-1 新增到 MmSYNA 和 MmSYNB 顆粒的上清液中，以增強體外轉導。在這些原代細胞中，VSVg 和 MmSYNA 都啟用了 SEND 介導的 Mm。cargo（Cre） 功能轉移，而 MmSYNB 則沒有。

同樣，這種包裝是高度特異性的，因為只有 UTR 側翼的 mRNA ［即 Mm。cargo（Cre）］ 被功能轉移。與 MmSYNA 一起，SEND 可以配置為功能基因轉移的完全內源系統。

圖示：SEND 是一個模組化系統，能夠將基因編輯工具傳遞到人類和小鼠細胞中。（來源：論文）

之後研究人員開始探索 MmPEG10 介導的 MmPeg10 RNA 在神經元中的內源性作用。攜帶天然 PEG10 轉錄本的 MmSYNA 假型 VLP 的功能轉移到原代小鼠皮層神經元，導致許多參與神經發育的基因上調。

為了進一步表徵該系統元件的模組化，研究人員測試了不同的貨物 RNA。測試了 SEND 是否可以介導大~5-kb Mm。cargo（SpCas9）的功能轉移到 N2a 細胞系中，這些細胞系組成性表達針對 MmKras 的單一向導 RNA（sgRNA）。

SEND 能夠在功能上轉移 SpCas9，導致受體細胞中約 60% 的插入和缺失（indels）；與 Cre 的結果相似，SEND 是特異性的，只能有效地功能轉移 SpCas9，兩側是全長或最佳化的 Peg10 UTR 序列。

為了建立用於遞送 sgRNA 和 SpCas9 的多合一載體，研究人員測試了 SEND 是否可以有效遞送 sgRNA。並將它們與表達 Cas9 的 N2a 細胞一起孵育；即使直接轉染嚮導顯示強大的插入缺失形成，也可以檢測到非常少的活性。

圖示：SEND 是一個模組化系統，能夠將基因編輯工具傳遞到人類和小鼠細胞中。（來源：論文）

來自內源性逆轉錄元件的 SEND 的發展，補充了現有使用脂質奈米顆粒的遞送方法、源自逆轉錄病毒的 VLP 方法以及 EV 中的主動 mRNA 載入方法。此外，與目前可用的病毒載體相比，SEND 可能具有較低的免疫原性，因為它使用了內源性人類蛋白質。作為一個模組化的、完全內源性的系統，SEND 有可能擴充套件到一個可以重複給藥的最小免疫原性遞送平臺，這極大地擴充套件了核酸治療的應用。

「

我們很高興能繼續推進這一方法

」，張鋒說，「

我們可以使用PEG10或者其他蛋白質，在

人體

中設計一個傳遞途徑，包裝和交付新的RNA和其他潛在的基因療法；這是一個非常強大的概念。

」

論文連結：

https：//science。sciencemag。org/content/373/6557/882

相關報道：

https：//medicalxpress。com/news/2021-08-scientists-harness-human-protein-molecular。html