黃精褐斑病的病原生物學特性

黃精褐斑病的病原生物學特性網路首發論文

黃精 Polygonatum sibiricum Red。為百合科Liliaceae 黃精屬 Polygonatum Mill。多年生草本植物，廣泛分佈於我國除南方熱帶以外的廣大地區（中國科學院中國植物誌編輯委員會 1978）。傳統醫學認為，黃精具有補腎益精、滋陰潤燥之功效，長期用於治療腎虛虧損、體倦乏力等症（陳曄和孫曉生 2010；Xian et al。 2012）。現代醫學研究發現，黃精還具有抗衰老、提高免疫力、調節造血能力、消炎、抗腫瘤和降血糖等多種功效（Kato et al。 1994；王慧等 2017）。近年來，隨著黃精研究的深入及應用領域的拓展，該藥材需求量日益增大，因此，黃精中藥材人工栽培面積不斷擴大（楊子龍等 2002；張平 2002）。在黃精栽培過程中由於管理不當、種植年限延長等因素，導致葉斑病、葉枯病、炭疽病和莖腐病等多種病害逐年加重，這些病害多發生在 7–9 月，嚴重影響到黃精根狀莖的產量和品質（田啟建和趙致 2006；周先治等 2018）。目前，對黃精病害的發生與防控方面的研究還相對有限。

2017 年 7 月，作者在貴州省施秉縣牛大場鎮中藥材基地栽培的黃精植株上發現了一種葉部新病害，主要危害黃精葉片，病部產生橢圓狀褐色斑點，有黃色暈圈，嚴重時病斑連成一片造成葉片壞死。該病害發展迅速，嚴重時可引起植株地上部分枯死，顯著降低了藥農的經濟收益，制約了當地黃精產業的發展。為明確該病的病原菌，本文對該病害進行了病原分離鑑定和致病性測定並研究了病原菌的部分生物學特性，以期為當地黃精葉斑病害的發生和綜合防治提供理論依據。

1 材料與方法

1。1 病害樣品採集

2017 年 7 月，在貴州省施秉縣牛大場鎮中藥材基地中採集具有典型發病症狀的黃精葉片樣品，帶回實驗室備病原菌分離培養。

1。2 培養基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）培養基、查氏瓊脂（Czapek）培養基、麥芽浸膏瓊脂（MEA）培養基、水瓊脂培養基（WA）和燕麥片瓊脂（OMA）培養基（方中達 1998）。

1。3 病原菌的分離與形態學鑑定

採用組織分離法（方中達 1998）從黃精葉片的病健交界處切取 5mm×5mm 小塊組織，在75%酒精中浸泡 10s 後，於 0。1%昇汞中浸泡3min，再用無菌水將組織沖洗 4 次，最後用無菌吸水紙吸乾，將其接種至加有微量鏈黴素、青黴素的 PDA 平板上，每個平板接 3 塊，於 25℃培養 5d 後挑取菌落邊緣少量菌絲體進行轉接培養，並進行單孢分離獲得純培養物（代表菌株HGUP17281），該菌株於 25℃培養 7d 後，進行菌落觀察和顯微微形態觀察。

1。4 致病性測定

在 2018 年 7 月，選取 1 年生新鮮健康黃精葉片，用無菌水沖洗乾淨，用脫脂棉包裹葉柄處後放置於加有濾紙的培養皿（d=9cm，下同）中，皿底加適量水潤溼。將菌餅（d=5mm，下同）接種於經接種針（已滅菌）劃傷的葉片（菌落正面緊貼在葉片傷口處），每葉接種 2 個菌餅，共 3 個重複處理。以接種無菌菌餅的葉片作為對照。將各處理置於室溫（25℃）保溼培養。接種 2d 後開始觀察發病症狀，7d 後除去菌餅，記錄病斑大小和顏色。待接種葉片發病後再進行分離培養（徐海嬌等 2017）。

1。5 病原菌分子生物學鑑定

菌株經 PDA 培養後收集菌絲體，採用Biomiga Fungal gDNA Kit［生工生物工程（上海）股份有限公司］提取供試菌株基因組 DNA，選擇引物 ITS（ITS1/ITS4）、β-tubulin（Bt2a/Bt2b）、tef1 （EF1-526F/EF1-1567R） （Maharachchikumbura

et al。 2012）進行 PCR 擴增。反應體系為 20μL：10×PCR 反應緩衝液 2μL，dNTPs（10mmol/L）1。6μL，引物（10μmol/L）各 0。5μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0。2μL，DNA 模板 1μL，ddH 2 O 補足 20μL。ITS-PCR 反應條件：95℃預變性 5min；95℃變性 30s，52℃退火 45s，72℃延伸 90s，35個迴圈；72℃延伸 10min。tef1 基因 PCR 反應條件：94℃預變性 5min；94℃變性 30s，63–53℃或 66–56℃（每迴圈降低 1℃）退火 45s，72℃延伸 90s，36 個迴圈；72℃延伸 7min。β-tubulin基因 PCR 反應條件：95℃預變性 3min；95℃變性 1min，55℃退火 50s，72℃延伸 1min，35 個迴圈；72℃延伸 10min。反應產物經 1。2%的瓊脂電泳檢驗，將 PCR 產物送交生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序結果在 NCBI（http：//www。ncbi。nlm。gov）資料庫中進行 BLAST比對分析後提交到 GenBank。

從相關參考文獻蒐集模式菌株資訊，並從 GenBank 中分別下載其對應的基因序列（Maharachchikumbura et al。 2014；冉雙飛2017） ，用 Bioedit 比對目標序列（ClustalWMultiple alignment）後轉換為 Fasta 檔案，用系統發育分析軟體 PAUP* 4。0 Beta 10 執行此檔案，執行最大簡約法的分析運算（Swofford 2002）。

1。6 病原菌生物學特性研究

1。6。1 碳、氮源對菌絲體生長的影響：以查氏培養基為基礎培養基，用等量的碳源（可溶性澱粉、葡萄糖、乳糖、D-果糖）及氮源（酵母浸膏、L-苯丙氨酸、蛋白腖、半胱氨酸）分別替代基礎培養基中的蔗糖和硝酸鈉，以不含碳源及氮源的培養基為對照，取菌餅接種於各培養皿中央。所有處理組均 3 個重複，25℃恆溫培養，7d 後用十字交叉法測量菌落直徑（秦人全等 2017），下同。

1。6。2 溫度對菌絲體生長的影響：在 PDA 培養基上接種病原菌，分別置於 5、10、15、20、25、30、35 和 40℃共 8 個溫度中恆溫培養。

1。6。3 pH 對菌絲體生長的影響：用 1 mol/L 的 HCL和 1 mol/L 的 NaOH 溶液將 PDA 的 pH 值分別調節至 4、5、6、7、8、9、10，共 7 個處理，接種菌餅。

1。6。4 光照對菌絲體生長的影響：將接種了菌餅的 PDA 置於完全黑暗、12h 明暗交替和完全光照3 個條件下培養。

1。6。5 培養基對菌絲體生長的影響：將菌餅分別接種至 PDA、PSA、WA、Czapek、OMA 和 MEA培養基上進行培養。

1。6。6 病原菌致死溫度測定：在盛有 5mL 無菌水的試管中加入病原菌，分別在 40、45、50、55、60、65℃的恆溫水浴鍋中加熱 10min，迅速冷卻後接種在 PDA 上，25℃恆溫培養，逐日觀察菌絲體生長情況。用 Excel 表格工具和 IBM SPSSStatistics 軟體對以上測量資料進行分析。

2 結果與分析

2。1 黃精褐斑病症狀

病斑呈圓形或不規則形，邊緣棕褐色至暗褐色，中間淡褐色並著生黑色小點（子實體），帶有黃色暈圈（圖 1A，B）；發病嚴重時，病斑中央組織壞死呈薄膜狀或穿孔，多個病斑能匯合形成大面積枯死斑，最終導致植株地上部分枯死（圖 1C）。

A：正面病斑；B：葉背病斑；C：田間自然發病症狀. D，G：接種葉片發病症狀（7d）；E，H：劃傷接種無菌菌餅的葉片（7d）；F，I：健康黃精葉片

2。2 致病性測定

對 7 片黃精葉片的 13 塊葉片病健交界組織中分離獲得了 9 個優勢菌株，根據菌落形態特徵和顯微形態特徵將這些菌株鑑定為一個類群，分出率為 69。23%（代表菌株 HGUP17281）。經致病性測定，發現劃傷接種 3d 後葉片開始發病，產生邊緣深褐色、中間淡褐色的病斑，直徑0。12–0。15cm；接種 7d 後，病斑擴大，直徑0。54–1。52cm，病斑邊緣出現黃色暈圈（圖 1D，1G）。劃傷不接菌的對照葉片在 7d 後僅出現機械損傷（圖 1E，1H）。經對顯症部位再次進行病菌分離培養，再次得到形態一致的病菌。試驗結果表明菌株HGUP17281是黃精褐斑病的致病菌。

2。3 病原菌的形態學鑑定

病原菌在 PDA 上，25℃黑暗培養 7d，菌落直徑達 7。0cm；菌絲體白色、絮狀，背面淡黃色（圖 2A，B）；15d 後菌落正面出現黑色分生孢子盤，上生分生孢子粘液團（圖 2C）；產孢細胞無色透明，棒狀，12。54–25。41×2。11–4。69µm（圖 2D-E）；分生孢子紡錘形或梭形，直立或稍彎曲，18。72–24。50×4。10–5。30µm，具 4 隔膜，分隔處縊縮，中間 3 個細胞淺褐色，細胞壁較厚；兩端細胞（頂細胞和基細胞）無色、錐形，細胞壁薄；頂部附屬絲2–3根一簇，長11。70–17。20µm，底部附屬絲單生，長 3。10–6。50µm（圖 2F）。根據以上形態學特徵，將病原菌 HGUP17281 鑑定為擬盤多毛孢屬 Pestalotiopsis 真菌。

A-B：菌落形態（PDA，7d）；C：分生孢子盤（PDA，15d）；D，E：分生孢子盤（15d）；F：分生孢子（15d）.標尺：C=200μm；D，E=30μm；F=20μm.

2。4 病原菌的分子生物學鑑定

對供試菌株的 rDNA-ITS、β-tubulin 和 tef1基因進行擴增和測序，分別獲得 540bp、425bp、927bp 的基因片段，將序列提交至 GenBank 資料庫 ， 分 別 獲 得 序 列 登 錄 號 為 MH660397 、MH660395、MH660396。透過系統發育分析，供試菌株HGUP17281與Pestalotiopsis trachicarpicolaY。M。 Zhang & K。D。 Hyde（菌株號分別為 12-0267、OP068）菌株聚於同一分支，且支援率達 100%，與其他種類明顯不同。因此，結合菌株的形態特徵，將黃精褐斑病病原菌 HGUP17281 鑑定為棕櫚擬盤多毛孢 P。 trachicarpicola。

圖 3 基於 rDNA-ITS、β-tubulin、tef1 序列構建菌株 HGUP17281 的多基因系統發育樹

分支上的資料表示 Bootstrap 檢驗的支援百分率，自展支援值（Bootstrap）>50%的顯示在各個進化分支節點上，Neopestalotiopsis saprophytica 作為外群，HGUP 17281 是試驗菌株

2。5 病原菌生物學特性研究

2。5。1 碳、氮源對菌絲體生長的影響：試驗結果表明（圖 4A，4B），供試的 5 種氮源和碳源均能促進病原菌生長，但存在明顯差異，其中最適宜的碳源和氮源分別是葡萄糖和酵母浸膏。

2。5。2 溫度對菌絲體生長的影響：試驗結果表明（圖 4C），病原菌菌絲體的適宜生長溫度為15–30℃，其中最適生長溫度為 28℃。當溫度低於 15℃或高於 30℃時菌絲體生長遲緩甚至停止。

2。5。3 pH 對菌絲體生長的影響：試驗結果表明（圖 4D），病原菌在 pH4-10 範圍內均可生長，但最適 pH 為 5。總體來說，菌絲體在偏鹼性條件下生長比較緩慢，而在偏酸性條件下相對有利於菌絲體生長。

2。5。4 光照對菌絲體生長的影響：試驗結果顯示（圖 4E），24h 持續光照、24h 持續黑暗、12h光暗交替處理下各菌落直徑無顯著差異。不同光照處理對病原菌菌絲體生長無顯著影響。

2。5。5 培養基對菌絲體生長的影響：試驗結果表明（圖 4F），該菌在 WA 之外的 5 種供試培養基上均能生長。其中 PDA 最適於菌絲體生產，其次為 PSA、Czapek 培養基（6。83–7。34cm），而OMA 和 MEA 培養基相對較差。

2。5。6 病原菌菌絲體致死溫度：病原菌經 40℃處理 10min 後接種於 PDA 培養基上仍能繼續生長，但溫度高於 45℃時 10min 後無法生長，由此確定該菌菌絲體的致死溫度是 45℃。

3 討論

黃精葉斑類病害是危害黃精的重要病害，當前，國內對黃精葉斑類病害的研究報道有限，田啟建等（2008）和鄒娟等（2018）分別報道了鏈格孢屬 Alternaria sp。 Septoria sp。和草莖點黴Phoma herbarum 可引起黃精的葉斑病和黑斑病。此次研究將黃精褐斑病的病原鑑定為棕櫚擬盤多毛孢 P。 trachicarpicola，是一種新發現的黃精葉斑病病原。此次生物學特性研究結果顯示該病原較適宜在 pH 值 5，加酵母浸膏的 PDA 培養基中於 28℃恆溫環境下培養。這些研究結果與葛起新等 （2009）和石凌波（2017）的研究結果基本一致。

A：碳源處理；B：氮源處理；C：溫度處理，x：℃；D：pH 處理；x：pH 值；E：光照處理；F：培養基型別，y：菌落直徑（cm），資料後不同字母表示差異顯著（P<0.05）

擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis真菌寄主範圍廣，部分種有致病性，如 P。 uvicola 危害葡萄的葉片、樹皮和果實（Sergeeva et al。 2005；Urberz-Torres etal。 2012），近年來發現 Pestalotiopsis 屬部分真菌也引起植物的葉斑類病害（Maharachchikumburaet al。 2014），如擬盤多毛孢 P。 clavispora 引起草莓葉斑病（趙景楠等 2016），P。 longiseta 引起野茶樹Camellia sinensis 的灰斑病（Maharachchikumbura etal。 2013）。部分非致病種是植物的內生菌，其中某些種如 P。 mirospora 和 P。 neglecta 的次生代謝物具有抗菌活性，具有一定的醫學研究價值（Strobel et al。 2002；Sharma et al。 2016；Sessa etal。 2018）。

棕櫚擬盤多毛孢 P。 trachicarpicola 能寄生於棕 櫚 Trachycarpus fortunei （ 雲 南 昆 明 ） 、Chrysophullum sp。（雲南昆明）、木荷 Schima sp。（湖南宜章縣）、山礬 Sympolocos sp。（湖南宜章縣）等多種植物的葉片上（Maharachchikumbura2012）。對部分植物有致病性，但相關報道較少，已知能引起棕櫚、杜仲 Eucommia ulmoides 等植物的葉斑病（Zhang et al。 2012；Li et al。 2018），也是葡萄枝幹病害和果實軟腐病的弱致病種（Jayawardena et al。 2015）。Maharachchikumburaet al（2016）從法國葡萄種植區發病的葡萄樹幹中分離出一株棕櫚擬盤多毛孢 P。 trachicarpicolaICMP20420，但未記載致病性相關測試。

傳統形態學透過分生孢子、頂端附屬絲或培養性狀的形態差異等特徵確定擬盤多毛孢Pestalotiopsis 的種類，由於這些表徵的形態較為接近，界限模糊，給 Pestalotiopsis 屬真菌的種類鑑定帶來一定的困難（Maharachchikumbura et al。2011）。為更好地區分 Pestalotiopsis 屬的部分近緣種，Jeewon et al（2003）使用 ITS 序列評估了Pestalotiopsis 在分類學方面的系統發育特徵，Huet al（2007）的研究顯示 TUB（β-tubulin）基因能更好地將 Pestalotiopsis 屬真菌鑑定到種，並提出至少聯合 ITS 與 TUB 兩種基因片段區別Pestalotiopsis 的物種，Maharachchikumbura et al。（2012）用肌動蛋白、鈣調素、谷氨醯胺合成酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、ITS、LSU、18S nrDNA、RNA 聚合酶 II，TEF 和 TUB 等 10 個基因區確定 Pestalotiopsis 的種間區別，確定了 ITS，TUB 和 TEF 是較好的分子標記。本次實驗參考 Maharachchikumbura et al。 （ 2012 ） 對Pestalotiopsis 的分類研究結果，聯合 ITS、β-tubulin 和 tef1 3 段基因進行系統發育分析，確定黃精褐斑病的病原菌為棕櫚擬盤多毛孢Pestalotiopsis trachicarpicola。

生 物 學 特 性 的 初 步 研 究 結 果 表 明 P。trachicarpicola 是喜高溫菌，適宜在高溫偏酸土壤環境中生長，較容易在貴州等我國南部地區發生。在生產上可以透過適當遮蔭、土壤中增施石灰和磷鉀肥來控制褐斑病的發生。本研究新發現了一種黃精葉斑類病害病原菌，並初步研究了其部分生物學特性，可為該病的田間監測、發生和防治提供一定參考。