科技|生香酵母在二鍋頭酒釀造過程中的應用

釀酒酵母是什麼

作者|周森（1986-），男，工程師，在職研究生，研究方向為白酒釀造微生物，北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，農業部華北都市農業重點實驗室。

牛欄山二鍋頭屬於清香型白酒，是我國白酒三大香型之一。在牛欄山釀造過程中，酵母菌分別在糖化、產酒和生香方面起著重要作用。前期研究表明，二鍋頭釀造過程中酵母菌可分為扣囊覆膜酵母、釀酒酵母和生香酵母三大類，其中扣囊覆膜酵母能夠產生高活力的澱粉酶，具有同時水解α-1，4和α-1，6-糖苷鍵的能力，常被認為是發酵前期的糖化菌；釀酒酵母能夠將發酵環境中的糖類物質在厭氧環境下轉化為乙醇，是牛欄山二鍋頭髮酵的主要產酒菌；生香酵母則是一類能夠代謝酯類物質的酵母菌總稱，能夠在生長、繁殖過程中產生芳香氣味物質。

目前，人們發現白酒釀造過程中生香酵母對酸和醇具有不同程度的酯化能力，並且在代謝過程中能夠生成多種風味化合物，是酯類物質的主要來源。在牛欄山二鍋頭釀造過程中，生香類酵母可分為扁平雲假絲酵母（Candidahumilis）、庫氏畢赤酵母（Pichiakudriavzevii）、戴爾凱氏有孢圓酵母（Torulasporadelbrueckii）、發酵畢赤酵母（Pichiafermentans）、異常畢赤酵母（Pichiaanomala）、粉狀畢赤酵母（Pichiafarinosa）及異常威克酵母（Wickerhamomycesanomalus），王勇等利用高粱和酒醅作為培養基，分別測定了不同生香酵母代謝產物，確定出庫氏畢赤酵母（P。kudriavzevii）和異常威克酵母（W。anomalus）具有高產乙酸乙酯能力。乙酸乙酯是構成二鍋頭酒風味的主體酯類，常表現為水果香、花香和甜香，對二鍋頭酒香氣貢獻較大。因此本研究利用純培養技術製備庫氏畢赤酵母和異常威克酵母菌劑，按不同新增量加入地缸中進行固態發酵，根據基酒乙酸乙酯含量變化，評定不同生香酵母在二鍋頭釀造過程中的實際應用價值。

材料與方法

材料與方法

菌株：牛欄山酒廠菌種庫保藏庫氏畢赤酵母、異常威克酵母。

試劑：三氯甲烷、異丙醇、醋酸鉀、硫酸（均為分析純），北京化工廠；乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA）、0。5%十二烷基硫酸鈉（sodiumdodecylsulfate，SDS），上海生工生物工程有限公司。

酵母富集培養基：YPD培養基：yeastextract10g，蛋白腖20g，葡萄糖20g，水1L。

酵母分離培養基：YPD培養基：yeastextract10g，蛋白腖20g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1L，115℃滅菌30min，倒平板前加入20mg/L氯黴素。

菌劑凍存劑：甘油120mL，海藻糖30g，脫脂牛奶60g，水480mL，115℃滅菌30min。

儀器裝置：北京東聯哈爾儀器製造有限公司BSC-1100ⅡA2型生物安全櫃；德國Eppendorf公司1-14k高速冷凍離心機；美國賽默飛世爾科技公司MultifugeX1R臺式冷凍離心機；寧波江南SPX-320型生化培養箱；7890B氣相色譜儀，美國安捷倫公司。C1000快速梯度基因擴增儀、PowerpacBasic基礎型水平電泳儀、GelDocXR+BIO-RAD全自動凝膠成像儀，美國BioRad公司；Waters2695高效液相色譜儀。

1.1材料、試劑及儀器

1。2。1菌劑製備

利用YPD固體培養基活化庫氏畢赤酵母和異常威克酵母，接種環挑一環活化菌體於100mLYPD液體培養基中28℃，200r/min培養48h，吸取10mL菌液加入到YPD液體培養基中（500mL）放大培養，28℃，200r/min搖床培養3d後，8000r/min離心菌液收集菌體沉澱。根據沉澱量加入菌劑凍存液，混勻後-80℃攝氏度凍存。

1。2。2菌種新增

按清香型白酒正常工藝進行發酵實驗，工藝操作流程如下：將破碎好的高粱（4瓣、6瓣、8瓣）用熱水浸潤24h，裝甑清蒸90min，蒸完後取出攤晾，加入大麴粉後拌勻，入缸發酵，待酒醅發酵成熟（28d），新增適量輔料，拌勻，蒸酒。以正常釀造工藝作為對照組，新增菌劑作為實驗組，新增量如表1所示。

表1實驗組菌體新增量

注：為便於統計，將庫氏畢赤酵母標記為PK、異常威克酵母標記為WA。

1。2。3發酵菌群跟蹤

跟蹤發酵過程，取發酵5d、10d酒醅進行酵母分離，檢測強化菌在發酵中生長情況。

分離培養：稱取發酵5d、10d酒醅10g於90mL無菌水中混勻，擬定為10-1濃度，吸取1mL於9mL無菌水中，標記為10-2，依次稀釋為10-3、10-4、10-5、10-6梯度。吸取不同梯度液0。1mL，分別塗布YPD平板中。根據菌落的生長情況，30℃培養24~48h。

菌落計數：挑選菌落數在30~300的平板，根據酵母菌形態差異，分類別單獨計數，採用PCR在不同類別中隨機抽樣鑑定20~30株，確定該類別酵母準確分類，並根據稀釋倍數計算不同酵母菌的種群數量。

1。2。4酵母PCR擴增及測序

挑取少量活化的菌體，於1。5mL離心管內；加入100μL裂解液（100mMTris，30mMEDTA，0。5%SDS，pH8。0，115℃滅菌30min備用）；100℃水浴15min；加入100μL2。5mol/L的醋酸鉀溶液，冰浴60min；4℃下12000r/min離心5min，取上清

（原載於中國白酒雜誌第202001

期）

液200μL至0。5mL離心管中；加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），劇烈振盪10min，12000r/min離心15min，移取100μL上清液至0。5mL離心管中；加入100μL預冷的異丙醇，混勻後-20℃下放置20min；12000r/min離心15min，棄去上清液；用70%的酒精洗滌沉澱2次；沉澱過夜自然乾燥；加入50μL已滅菌的超純水，室溫下溶解1h，-20℃冰箱儲藏備用。

表2酵母PCR引物序列

對所提取的酵母菌DNA進行26SrDNAD1/D2區片段擴增，採用通用引物NL1/NL4，如表2所示。

PCR反應條件：94℃加熱3min使模板DNA變性，然後進入下列溫度迴圈：94℃變性30s，50℃退火30s，72℃延伸45s，共進行35個迴圈，最後在72℃延伸5min。

PCR產物送公司測序後，用Chromas軟體分析測序質量，去除峰圖不可靠的部分，對DNA序列進行手動校正，用校正後的序列在美國國家生物技術資訊中心進行同源序列搜尋，比較該菌株在D1/D2序列上親緣關係最近的已知酵母菌資訊，可以根據序列同源性初步判斷待測菌株的分類地位。利用軟體MEGA5。10對所有序列進行比對後，刪除兩端未對齊的鹼基生成進化樹，並進行1000次的Bootstrapmethod檢驗。採用鄰接（neighbor-joining，NJ）法顯示進化樹，判斷待測菌株的分類地位。

1。2。5酒醅產酸、產酒測定

樣品處理：取出池酒醅10g，至50mL離心管中，加入30mLMiliQ水，顛倒混勻後常溫200W超聲萃取40min，吸取上清液2mL，12000r/min離心20min，0。22μm濾膜過濾後利用液相色譜測定酒醅中酒精和乙酸、乳酸含量。

液相色譜條件：柱溫60℃，檢測器溫度50℃，流速0。6mL/min，進樣量10μL。分離柱：Bio-RedHPX87H125-0140；保護柱CationHCartridge125-0129；流動相：5mMH2SO4。

1。2。6基酒色譜成分檢測

發酵結束後，將所獲得基酒降至60%vol，利用氣相色譜對基酒揮發性物質進行骨架成分分析。

氣相色譜條件：CPwax57色譜柱（50m×0。25mm×0。2μm）；進樣口溫度250℃；進樣量0。8μL；分流比=30∶1；控制方式流量；檢測器溫度280℃；柱流速1mL/min；空氣流量300mL/min；氫氣流量30mL/min；尾吹氣流量25mL/min；柱箱溫度：35℃保持3min，以1℃/min升至50℃，再以20℃/min升至200℃，保持15min。

1.2實驗方法

結果與分析

在前期研究中，我們發現牛欄山二鍋頭釀造過程中產酯酵母主要集中在發酵前中期。因此我們跟蹤發酵過程，採集發酵5d和10d樣品，對發酵過程不同類別酵母菌進行數量統計和種屬鑑定，判斷實驗組中所加生香酵母生長情況。鑑定和分離結果如圖1所示。

本研究採取不同類酵母菌隨機抽樣鑑定方式，鑑定酵母菌230株，共分為4個種，分別為

（原載於中國白酒雜誌第202001

期）

扣囊覆膜酵母（S。fibuligera）、異常威克酵母（W。anomalus）、釀酒酵母（S。cerevisiae）和庫氏畢赤酵母（P。kudriavze-vii）。將鑑定結果與酵母數量相結合，確定不同發酵階段酵母菌數量關係，如圖2所示。

圖1酵母菌基於26SrDNA的D1/D2序列構建的發育樹

圖2發酵5d、10d酵母菌數量關係圖

由圖2可知，發酵5d樣品均含有扣囊覆膜酵母和釀酒酵母：扣囊覆膜酵母數量在4。9~5。9log（cfu/g）之間，與對照組數量差異在0。4~0。6log（cfu/g）之間；實驗組釀酒酵母數量在7~7。4log（cfu/g）之間，稍低於對照組，相差在0。1~0。4log（cfu/g）。對照樣品中並未分離到生香酵母，PK樣品組中不同新增量中均能分離到庫氏畢赤酵母，分別為7。4log（cfu/g）和7。1log（cfu/g）；在WA樣品中，WA-1組並未分離到異常威克酵母，WA-2組中分離獲得5。7log（cfu/g）異常威克酵母。在發酵10d，5組樣品中酵母菌均為釀酒酵母，數量在7。5~7log（cfu/g）。

透過上述資料可以確定，實驗組與對照組中扣囊覆膜酵母和釀酒酵母數量基本一致，說明發酵主體酵母菌群並未因為新增強化菌而發生改變。在實驗組中，除WA-1組外，其餘實驗組在發酵5d均能分離到所新增菌種，在10d樣品中無法分離到，說明在二鍋頭釀造過程中，上述兩種生香酵母僅在發酵前期存活，而隨著發酵的進行，發酵環境發生變化，兩種生香酵母逐漸死亡。

結果與分析

生香酵母不僅具有較強的產酯能力，同時還能夠生成多種有機酸類物質，有機酸是二鍋頭酒中重要的呈香物質和酯類合成前體，同時也在白酒風味調節中起重要作用。王勇等利用離子色譜檢測了二鍋頭酒中主要有機酸類物質，確定了乳酸和乙酸含量遠高於其他有機酸類，是二鍋頭酒中主要有機酸。因此本研究利用液相色譜，測定實驗出池酒醅乳酸、乙酸和乙醇含量，判斷兩種生香酵母對發酵產酸、產酒方面的影響。

圖3出池酒醅酒精、乙酸、乳酸含量圖

由圖3可知，對照樣品酒精含量為33。18g/L，實驗組酒精含量為25。67~30。71g/L，均低於對照樣品，且隨著菌體新增量與酒精含量成反比；在乙酸生成量中，對照酒醅乙酸含量為0。44g/L，PK組乙酸含量明顯高於對照組，與對照組相比分別提高了54。5%和47。7%，WA組乙酸含量稍高於對照組，提高量為11。4%和20。5%；在乳酸生成量中，實驗組與對照組乳酸含量相差不大。可以看出，在發酵過程中，庫氏畢赤酵母和異常威克酵母均降低了酒醅中酒精含量，同時提高了酒醅中乙酸含量。

2.1酵母種屬生長情況

利用氣相色譜測定5組基酒揮發性成分，共檢測到33種化合物，其中酯類物質19種，醛類4種，醇類10種，見表3。

酯類是二鍋頭酒中重要呈香物質，大部分表現為水果香和花香。目前普遍認為，生香酵母具有較強的產酯能力，因此本次實驗基酒，重點關注乙酸乙酯含量變化情況。如表3所示，實驗組中乙酸乙酯含量均高於對照組，其中PK-1組和WA-2組產

（原載於中國白酒雜誌第202001

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乙酯量最高，含量分別達到6492。68mg/L和6148。80mg/L，比對照組提高了28%和21。2%。乳酸乙酯同樣是二鍋頭酒中重要的酯類化合物，在5組產物中，乳酸乙酯含量基本持平，說明兩種酵母的新增並未影響乳酸乙酯的合成。

表3基酒揮發性成分含量（mg/L）

注：ND表示未檢出。

從新增量角度分析，PK樣品組中，PK-2新增量要高於PK-1，但較高的新增量並未使基酒中乙酸乙酯含量高於PK-1組；WA樣品組中，WA-2新增量高於WA-1，其乙酸乙酯含量高於WA-1。

除結果中乙酸乙酯、乳酸乙酯兩種含量較高的酯類物質，將其餘17種含量較低的酯類物質，利用HemL1。0。3。3處理後進行熱圖分析，獲得5組基酒樣品微量酯類變化圖，如圖4所示。

圖4基酒酯類含量分析圖

結合圖4和表3可以看出，在含量較低的酯類物質中，與對照組相比，實驗組中提高較為明顯的酯類物質為乙酸異戊酯、十六酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯，剩餘酯類物質含量差異並不明顯。說明兩種生香酵母除提升基酒乙酸乙酯外，同時也提升了部分基酒中脂肪酸酯。

除酯類物質外，基酒樣品中同樣檢測到14種醇和醛類化合物，利用HemL1。0。3。3對資料處理後進行熱圖分析，獲得5組基酒樣品醇醛物質變化規律，如圖5所示。

圖5基酒醇、醛含量分析圖

根據圖5和表3可以看出，在醇類物質中，實驗組中含量增長較高的醇類物質為雜醇油類，如正丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇，並且發現菌體新增量與這幾種雜醇油生成量成正比關係，說明新增庫氏畢赤酵母和異常威克酵母除了能夠提高乙酸乙酯外，還能夠提升基酒中雜醇油類物質。4種醛類物質中，乙醛和乙縮醛是含量較高的醛類，對照組與實驗組之間含量差異不大，基本維持穩定。

2.2酒醅產酸產酒測定

在工藝不變的前提下，利用群落總數的新增方法可以有效的控制菌群新增量，能夠更加方便快捷的確定最優新增比例。同時利用傳統分離能夠發現，強化新增的庫氏畢赤酵母和異常威克酵母主要活躍在發酵前期，且並不影響其餘酵母菌群的正常增長。在代謝產物方面，兩種酵母菌均降低出池酒醅酒精含量，且酒醅酒精含量與菌體新增量呈反比關係；出池酒醅中乙酸含量提升明顯，與對照組相比，最高提高了54。5%，達到0。68g/L；基酒乙酸乙酯提升較為顯著，最高達到6492。68mg/L，提升28%；對酒醅乳酸含量和基酒中乳酸乙酯影響不大；在醇類合成方面，實驗組基酒雜醇油類稍有提升，且與菌體新增量呈正比關係；其餘組分影響不大。

透過4組實驗我們可以得出，兩種生香酵母在二鍋頭釀造過程中均能夠生成乙酸並降低酒醅中乙醇濃度，提高基酒乙酸乙酯含量，但同時也相應提高了基酒中雜醇油類物質。同時本次實驗初步確定新增7。5×1010cfu庫氏畢赤酵母和1。2×1011cfu異常威克酵母對提升基酒乙酸乙酯能力較為優秀。下一步將根據上述實驗成果，調節不同群落總數新增方案，篩選出適合二鍋頭釀造的最優新增比例進行中試生產，以達到提高基酒風味品質等目的。

（完）