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高彩霞研究組又發了NB,解析引導編輯系統的脫靶效應
由 BioArt植物 發表于 運動2021-06-26
簡介因此,研究人員重點評估了引導編輯系統是否造成不依賴pegRNA的全基因組範圍的脫靶效應
脫靶效應是什麼
責編 | 奕梵
新型基因編輯系統引導編輯
(prime editing, PE)
可以在基因組的靶向位點實現任意型別的鹼基替換、小片段的精準插入與刪除,這種靈活的、可設計的遺傳修飾能力使其在基礎研究、人類疾病治療和農作物育種中潛力巨大。引導編輯系統由nCas9
(H840A)
融合逆轉錄酶
(reverse transcriptase, RT)
和pegRNA
(prime editing guide RNA)
組成,在pegRNA的引導下,nCas9切割非靶標鏈產生缺刻,釋放出可與其PBS序列結合的遊離單鏈,從而起始逆轉錄酶對RT模板的逆轉錄過程,然後透過DNA修復將RT模板上對應的鹼基改變引入基因組。
脫靶效應是基因組編輯技術應用轉化時需要解決的一個重要科學問題,然而引導編輯系統在體內是否存在全基因組範圍的脫靶尚未知,亟待全面、系統的評估。
2021年4月15日,中國科學院遺傳與發育生物學研究所
高彩霞
研究組在
Nature Biotechnology
發表了題為
Genome-wide specificity of prime editors in plants
的研究論文。該研究在植物細胞及個體兩個水平上對引導編輯系統的脫靶效應進行了深入和系統的評估。
針對引導編輯pegRNA依賴型的脫靶效應,研究人員首先設計了一系列在pegRNA的間隔序列
(Spacer)
與引物結合位點
(PBS)
序列不同位置上分別引入數量不同的錯配鹼基,發現該系統對間隔序列近PAM端或PBS的5’端的錯配的容忍程度較低。研究人員進一步對179個潛在的內源脫靶位點的引導編輯情況進行高深度的檢測,發現引導編輯系統在水稻內源位點鮮有脫靶編輯。
因此,引導編輯系統的pegRNA依賴型的脫靶效應非常低,可透過pegRNA合理設計提升該系統的特異性。
高彩霞研究組前期研究表明,胞嘧啶鹼基編輯器BE3可能造成不依賴於嚮導RNA全基因組水平的脫靶效應
(點選檢視:專家點評Science | 中科院遺傳發育所高彩霞組首次在植物中發現單鹼基編輯系統存在嚴重脫靶效應)
。同時,由於水稻基因組小且再生植株具有相似的遺傳背景,可以克服動物全基因組重測序過程中大量的異質細胞序列分析的複雜性難題。因此,研究人員重點評估了引導編輯系統是否造成不依賴pegRNA的全基因組範圍的脫靶效應。透過對引導編輯水稻植株的全基因組測序分析,統計了全基因組範圍內的鹼基替換
(single nucleotide variants, SNVs)
和小片段插入與刪除突變
(small insertions/deletions, Indels)
數目,發現引導編輯系統的表達不會在基因組內引發額外的SNVs或Indels突變。
研究人員還分析了外源過表達含有M-MLV逆轉錄酶的引導編輯系統是否會干擾細胞內源的逆轉錄生物學過程。對水稻逆轉錄轉座子
OsTos17
和端粒區域的複製數及保真性分析顯示,引導編輯不影響逆轉錄轉座子的轉座活性以及端粒酶的活性。此外,對高丰度mRNA及pegRNA序列的逆轉錄-插入的可能性也進行了分析,同樣發現引導編輯系統沒有在全基因組範圍內產生pegRNA或mRNA序列的隨機插入。
以上結果表明,引導編輯系統不會造成全基因組範圍的不依賴於pegRNA的脫靶效應。
綜上所述,引導編輯系統在全基因組範圍具有很高的編輯特異性。
圖:在植物細胞與個體兩個水平上對引導編輯系統的特異性進行系統評價。
a,水稻原生質體水平分析179個脫靶位點處引導編輯系統的pegRNA依賴型脫靶突變。b,植物個體水平全基因組測序分析引導編輯系統pegRNA不依賴型脫靶突變的實驗流程與設計。c,d, control、PE和BE3處理組在基因組內的SNVs (c)與indels (d)數目。e,f, 各處理組中含有端粒reads分佈及數目比較。g, 比較control與PE處理組中Cas9與HPT編碼區的reads所佔T-DNA區域總reads的比例。
中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞研究組博士生
靳帥
、
林秋鵬
、
朱子旭
以及微生物研究所
駱迎峰
博士為本文的共同第一作者,
高彩霞
研究員為本文的通訊作者。該研究得到了國家自然科學基金委、國家重點研發計劃、中國科學院戰略性先導專項A、中國科學院前沿科學重點研究計劃與中國科學院青年創新促進會經費的資助
。
延伸閱讀:
Nature Biotech | 高彩霞/李家洋合作建立植物高效引導編輯設計策略
Nature Biotech | 遺傳所高彩霞研究組建立植物基因組引導編輯技術體系“Plant Prime Editing”
論文連結:
https://doi.org/10.1038/s41587-021-00891-x