《細胞》 ：骨髓竟是癌細胞全身轉移前的修煉場

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我們對癌症轉移策略的認知，又要重新整理了。

近日，美國貝勒醫學院Xiang H。-F。 Zhang教授團隊在《細胞》雜誌上發表了一項研究研究成果［1］。

他們發現：骨微環境可以透過影響腫瘤細胞的表觀遺傳特性重塑其轉移特性，從而影響這些腫瘤細胞向其他器官的繼發性轉移。他們發表的論文還指出，干預腫瘤細胞的表觀遺傳調控可有效抑制骨微環境介導的繼發性轉移。

這個研究揭開了腫瘤轉移在之前研究中鮮為人知的一面，為我們對腫瘤轉移的理解帶來了全新的視角。

▲ 論文首頁截圖

骨是乳腺癌和前列腺癌中最常見的轉移目的地［2］。在眾多器官的轉移中，骨轉移非常特殊，長期以來腫瘤領域對骨轉移的理解也頗有爭議。

一方面，與發生其他臟器轉移的癌症患者相比，僅發生骨轉移的患者具有更好的預後情況［3，4］；而另一方面，在轉移性乳腺癌病例中，高達45%的患者首個轉移灶出現在骨骼，且其發生頻率遠遠高於肺（19％）、肝（5％）和腦（2％）。

值得注意的是，在超過三分之二的病例中，轉移不僅限於骨骼，而是隨後發生在其他器官並最終導致患者死亡［3-5］。

基於這些臨床事實，作者猜想，乳腺癌的早期骨轉移可能暗藏玄機，可助推腫瘤細胞的再次大規模全身轉移。

但骨轉移研究最難的就是缺乏研究“武器”——小鼠模型。

研究者迎難而上，直接建立了以下幾種小鼠模型：（1）早期骨轉移模型：股動脈注射腫瘤細胞（IIA）或直接接種腫瘤細胞於骨內（IF）；（2）早期肺轉移模型：股靜脈注射腫瘤細胞（IIV）；（3）乳腺癌原位模型：接種腫瘤細胞於脂肪墊（MFP）。

對比分析乳腺癌細胞在以上三種模型中的轉移能力發現，相比於其他兩種模型，IIA/IF所形成的骨轉移小鼠中具有明顯更多的全身器官轉移。尤其令人震驚的是，IIA/IF骨轉移模型後期在肺部形成的腫瘤負荷居然高出IIV肺轉移模型10倍之多。

這些結果說明，早期定植於骨的腫瘤細胞明顯擁有更強的二次轉移能力。基於此，作者推測骨微環境可以增強腫瘤細胞的轉移能力。

▲ 乳腺癌細胞在三種小鼠模型中（IIA/IF， MFP， IIV）的轉移能力

但是IIA注射可能會損傷骨髓並刺激全身，這也會導致腫瘤多器官轉移。

為了客觀地分析這個問題，研究者還使用了小鼠共生體實驗進行了相應探索。研究者將兩隻小鼠的迴圈系統連通形成共生體系統［6］，對其中一隻小鼠透過IIA注射腫瘤細胞（IIA供體小鼠），另一隻小鼠不做處理（IIA受體小鼠）。

同時，作為對比，另一組共生系統的供體為荷有乳腺原位腫瘤的小鼠（MFP供體小鼠），另一隻也為不做處理的MFP受體小鼠。荷瘤的供體小鼠與無腫瘤的受體小鼠連線7周之後，透過手術將供體受體小鼠分離。飼養4個月後，分析受體小鼠的全身器官轉移情況。

結果發現，IIA組約有20%的受體小鼠中均發現了不同程度的臟器轉移，而MFP組所有受體小鼠中均沒有檢測到轉移的腫瘤細胞。

這個實驗結果說明了骨微環境促進的腫瘤二次轉移不是IIA注射導致的骨損傷帶來的全身性影響。

▲ 用於比較骨和乳腺腫瘤轉移能力的共生小鼠模型

那麼，這種骨轉移介導的腫瘤二次轉移，能在原位癌模型中也能自發性地產生嗎？

研究者利用了演化型條形碼技術用來追蹤小鼠體內腫瘤細胞的轉移情況。

條形碼技術是一種基於CRISPR/Cas9系統發展而來的技術［7，8］。Cas9蛋白的表達可以隨機突變細胞中的guide RNA的序列，隨機突變後的guide RNA稱為hgRNA。hgRNA序列的混亂度可計算夏農熵進行分析。根據不同細胞群體的夏農熵值，可以判斷不同細胞群體間的親子代關係。

也就是說基於hgRNA的條形碼追蹤技術可以分析不同器官形成轉移灶的先後順序和來源。

一般來說，由於子代轉移的腫瘤只是一部分親代腫瘤細胞定植新的器官後生長擴張的結果，因此，相比子代轉移細胞群體中的夏農熵會發生下降。並且這個規律作者透過上述IIA模型進行了相應驗證。

在本文中，研究者建立了帶有條形碼系統的MDA-MB-231和AT-3模型細胞，並把兩種模型細胞分別移植到了裸鼠和C57BL/6小鼠的脂肪墊構建了小鼠原位模型。當原位腫瘤長至1cm3；大小時，開始誘導腫瘤細胞內Cas9蛋白表達。

▲ 體內條形碼實驗設計示意圖

待腫瘤轉移完成後，研究者透過測序分析了小鼠中各器官轉移灶的條形碼資訊，得出了以下結論：（1）同一器官中的轉移灶並非來自於相同的親代腫瘤，然而早期各器官中的轉移灶卻來自於相同的親代克隆；（2）大部分轉移灶含有多個獨立克隆；（3）在小鼠乳腺原位癌的自發轉移過程中，均有發現由骨轉移灶到其他器官的再次轉移；（4）轉移灶形成時長與其大小無相關性。研究者發現，一些高夏農熵的轉移灶腫瘤負荷卻非常小。

結合之前的研究結果，這些發現共同證明了，由骨轉移灶到其他器官的再次轉移在乳腺癌中可自發性產生。骨微環境與腫瘤細胞的相互作用對增強後期腫瘤細胞的轉移能力至關重要。

▲ 小鼠多器官轉移灶的夏農熵分析

那為什麼骨微環境可以增強腫瘤細胞的轉移能力呢？

在同期的另一篇文章中，該研究團隊報道了骨微環境可透過調節組蛋白甲基轉移酶EZH2的活性，重塑ER+乳腺癌細胞使其失去luminal特徵而獲得乾性特徵［9］，這是一種有利於腫瘤細胞轉移的表型。

基於此，作者想進一步猜想，骨微環境賦予腫瘤細胞的增強的腫瘤轉移能力，很可能是在一定程度上是透過影響腫瘤細胞表觀遺傳調控的去分化過程來實現的。

為了驗證這個猜想，他們把低轉移性的SCP21細胞（源於MDA-MB-231的克隆）分別移植到小鼠脂肪墊、肺、後肢骨骼來構建體內相應器官的微環境培養模型。6周後重新從體內分離出這些在不同微環境中生長過的腫瘤細胞，經過實驗分析發現，與乳腺（脂肪墊）和肺相比，骨中分離出的細胞有更強的多器官轉移能力，並伴隨著高表達的乾性標誌物（ALDH1和CD44蛋白）以及EMT相關蛋白。

這就說明與乳腺微環境和肺部微環境相比，骨微環境可上調乳腺癌細胞的乾性特徵，進而賦予這些細胞更強的轉移能力。

▲ 骨微環境改造癌細胞機制圖

此外，研究者人員還發現了，相比於荷有原位腫瘤的模型小鼠，骨轉移模型小鼠中可檢測到明顯更多的迴圈腫瘤細胞（CTCs），並且這些CTCs同樣擁有更高表達的乾性標誌物。

對乳腺癌患者的CTCs進行單細胞測序分析後，同樣發現來自於骨轉移患者的CTCs中CD44的表達量遠遠高於其他患者。這些發現進一步證實了骨微環境可提高腫瘤細胞的乾性進而增強它們的轉移能力。

由於作者已在同期另一篇文章［9］中闡明瞭EZH2對乳腺癌細胞的乾性的調控發揮著重要作用。最後，作者進一步證明EZH2在骨微環境介導的腫瘤繼發性轉移中發揮著重要作用。

體外實驗發現，EZH2抑制劑EPZ的處理的確可以顯著下調骨微環境中腫瘤細胞的乾性和間充質標誌物。在小鼠模型中，EZH2抑制劑EPZ的預處理或EZH2的誘導敲低，均可有效抑制腫瘤細胞骨轉移後的繼發性多器官轉移，而不影響腫瘤細胞的增殖。

這些發現表明，EZH2可作為一個潛在靶點，用來抑制或預防骨微環境介導的腫瘤繼發性轉移。

▲ EZH2的敲低對腫瘤細胞轉移能力的影響

總而言之，在此文章中，研究者們利用複雜精巧的動物模型和邏輯嚴密的實驗設計，為我們理解早期癌症轉移以及骨微環境提供了全新的視野。

在腫瘤細胞轉移的漫漫征程中，骨微環境是途中的一個“中轉加油站”，為其蓄力，然後火力全開加速上路。而EZH2則是“油”中的主要燃料，抑制EZH2後，“中轉加油站”即形同虛設，腫瘤細胞有心無力，難以再次轉移。

在臨床中，如果可以透過干預手段破環骨微環境賦予腫瘤細胞的轉移驅動力，將有望預防後期的全身性轉移，能讓腫瘤控制在相對易於治療的範圍之內，使得更多患者獲得生的希望。

參考文獻：

［1］ Zhang W， Bado IL， Hu J， et al。 The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination ［published online ahead of print， 2021 Apr 10］。 Cell。 2021；S0092-8674（21）00296-8。 doi：10。1016/j。cell。2021。03。011

［2］ Kennecke H， Yerushalmi R， Woods R， et al。 Metastatic behavior of breast cancer subtypes。 J Clin Oncol。 2010；28（20）：3271-3277。 doi：10。1200/JCO。2009。25。9820

［3］ Coleman RE， Smith P， Rubens RD。 Clinical course and prognostic factors following bone recurrence from breast cancer。 Br J Cancer。 1998；77（2）：336-340。 doi：10。1038/bjc。1998。52

［4］ Coleman RE， Rubens RD。 The clinical course of bone metastases from breast cancer。 Br J Cancer。 1987；55（1）：61-66。 doi：10。1038/bjc。1987。13

［5］ Coleman RE。 Clinical features of metastatic bone disease and risk of skeletal morbidity。 Clin Cancer Res。 2006；12（20 Pt 2）：6243s-6249s。 doi：10。1158/1078-0432。CCR-06-0931

［6］ https：//www。jove。com/cn/t/50556/parabiosis-in-mice-a-detailed-protocol

［7］ Kalhor R， Mali P， Church GM。 Rapidly evolving homing CRISPR barcodes。 Nat Methods。 2017；14（2）：195-200。 doi：10。1038/nmeth。4108

［8］ Kalhor R， Kalhor K， Mejia L， et al。 Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR。 Science。 2018；361（6405）：eaat9804。 doi：10。1126/science。aat9804

［9］ Bado IL， Zhang W， Hu J， et al。 The bone microenvironment increases phenotypic plasticity of ER+ breast cancer cells。 Dev Cell。 2021；56（8）：1100-1117。e9。 doi：10。1016/j。devcel。2021。03。008

本文作者丨檸檬

原標題：《《細胞》 ：骨髓竟是癌細胞全身轉移前的修煉場！科學家利用DNA條形碼追蹤腫瘤轉移過程，發現腫瘤轉移的全新機制丨科學大發現》