《水質 發光細菌 高通量急性毒性測試方法》團體標準徵求意見

由上海市環境科學學會、江蘇省環境監測協會、浙江省環境監測協會聯合組織編制的團體標準《水質 發光細菌 高通量急性毒性測試方法》已形成徵求意見稿。按照《上海市環境科學學會團體標準管理辦法》、《江蘇省環境監測協會團體標準管理辦法（試行）》、《浙江省環境監測協會團體標準管理辦法（試行）》的有關要求，現公開徵求意見。

本檔案按照GB/T 1。1-2020《標準化工作導則 第1部分：標準的結構和編寫》的規定起草。參考GB/T 5750。2 生活飲用水標準檢驗方法水樣的採集與儲存；GB/T 6682 分析實驗室用水規格和試驗方法；GB 17378。3 海洋監測規範 第3部分：樣品採集、貯存與運輸；HJ/T 91 地表水和汙水監測技術規範；HJ 91。1 汙水監測技術規範；HJ/T 164 地下水環境監測技術規範等規程編制。

本標準規定了高通量測定水質急性毒性的發光細菌法。本標準適用於測定地表水，地下水，飲用水、生活汙水，工業廢水及海水的發光細菌急性毒性。

方法原理：

發光細菌暴露在無毒性的水體中可以正常發光，當水體中含有環境毒物時，發光便會受到抑制，受抑制程度與毒物濃度之間有較好的正相關關係。本標準使用高通量的96孔板作為反應載體，透過生物發光檢測儀測定系列稀釋的環境水樣（如地表水，地下水，飲用水、生活汙水，工業廢水及海水）與發光細菌接觸一定時間後的發光強度變化，可以利用發光細菌的相對發光強度（Tt）、相對抑制率（Ht）與稀釋系列濃度的曲線關係獲得效應濃度（EC）、毒性當量（TEQ）、毒性單位（TU）或最低無效應稀釋度（LID）來表徵水樣的急性毒性水平並評價毒性程度。

儀器和裝置：

1。適用於 96 孔板的、具有頂讀及生物發光檢測功能的儀器。2。pH 計：精確到 0。1 pH單位，測量範圍從0到14。3。溶解氧測定儀：精確到0。1mg/L。4。鹽度計：精確到0。1mg/L 或0。1%。5。電子分析天平：精度為0。0001g。6。培養箱：15℃，在一次測試中，溫度偏差不超過±1 ℃。7。冰箱：冷藏溫度2~8 ℃，冷凍溫度-18 ℃以下。8。渦旋混合器。9。平板振盪器。10。單通道移液器：200μL、1mL、5mL、10mL。11。多通道移液器：200μL 。

樣品的採集：

1。地表水、生活汙水和工業廢水的採集須符合HJ/T 91以及HJ 91。1要求的技術規範。2。地下水的採集須符合HJ/T 164要求的技術規範。3。飲用水的採集須符合GB/T 5750。2要求的技術規範。4。海水樣品的採集須符合GB 17378。3要求的技術規範。

樣品的儲存：

取樣瓶使用惰性材料製成（如聚四氟乙烯），務必清潔、乾燥。取樣時，水樣應該充滿容器，不留空氣，密封。樣品儲存在放有冰袋的保溫箱內運送回實驗室，6小時內分析。若樣品不能及時分析，應在 2~8 ℃的黑暗環境下冷藏儲存，但不得超過48小時。可在-18 ℃以下儲存長達兩個月。樣品的儲存不新增任何化學試劑。

樣品測試：

每次試驗設定空白對照、參比樣品對照和樣品組，每個組至少兩個平行。可測試的最小稀釋度為 1→1。25（80%樣品，D=1），作為幾乎未稀釋的樣品，可以透過將 4 體積的樣品與 1 體積的細菌懸液（例如 160 L 樣品和 40 L 細菌懸液）混合而製備，同時需要設定一個空白對照（D=1），透過 40 L 細菌懸液和 160 L 稀釋液進行配製。其他稀釋系列是由樣品試驗溶液和細菌懸浮液等體積混合的，白對照（D=2）每孔加入 100 L 細菌懸液和 100 L 的稀釋液，參比樣品對照每孔加入 100 L 細菌懸液和 100 L 的參比樣品溶液，樣品組每孔加入 100 L 細菌懸液和 100 L的樣品溶液（見附錄 B）。

參比樣品對照和樣品組 96 孔板排列方式參見附錄 C。在 96 孔板（6。10）中，使用多通道移液器（7。11），每孔加入細菌懸液後，立刻置於測試溫度下，等待 30 分鐘後，用發光檢測儀（7。1）測定發光強度，記錄為 I0；然後將樣品或稀釋後的樣品迅速加入到細菌懸液中，使用平板振盪器輕輕振盪搖勻（7。9），並置於規定的測試溫度下，在接觸 5 分鐘、15 分鐘或 30 分鐘時測定發光強度，分別記錄為 I5、I15、I30，不同微孔板的測定間隔宜在 30 秒以內。

結果計算與表示：

測試結果可以使用相對發光強度（Tt）、相對抑制率（Ht），也可以計算得到效應濃度（EC）、毒性當量（TEQ）、毒性單位（TU）或最低無效應稀釋度（LID）表示。

結果評價：

對於排放到自然水體中的任何廢水（如生活汙水、工業廢水），採用EC50值或 TU值評價樣品的急性毒性，EC50 值越小，測試樣品毒性越強；TU 值越大，測試樣品毒性越強。（更多詳情請見附件）