【科技前沿】管敏鑫教授課題組在Human Molecular Genetics發表基因編輯結合幹細…

2022年4月25日，浙江大學遺傳學研究所管敏鑫教授課題組在國際權威學術期刊《人類分子遺傳學》（Human Molecular Genetics）線上發表聾相關基因編輯結合幹細胞技術的最新研究成果，該研究透過CRISPR/Cas9 基因編輯技術對線粒體修飾基因突變進行遺傳矯正，在內耳毛細胞樣細胞中實現聽覺功能重塑，為耳聾的基因治療帶來“新的曙光”，是領域內的重要突破。

研究簡介：

耳聾是人類常見的感官缺陷疾病之一，可因遺傳和環境及其相互作用等多種因素導致。管敏鑫教授自1993年開始，一直從事母系遺傳性和藥物性耳聾致病機制和臨床轉化研究，首次闡明瞭線粒體12S rRNA 1555A>G、1494C>T突變是中國人群藥物性耳聾的主要分子致病基礎，攜帶該類突變的易感人群會對氨基糖苷類藥物超敏感而在用藥後致聾，破解了長期來困擾醫學界的“一針致聾”之謎，透過分子診斷、知識宣教、用藥指南和遺傳諮詢等方式，累計使近百萬名未發病的母系成員（包括孕期母親和新生兒）直接受益，有效地降低了耳聾的發生率，相關成果曾獲國家科技進步獎二等獎，已在Am J Hum Genet、Nucleic Acids Res等國際權威學術期刊發表相關論文80餘篇。

攜帶m。1555A>G突變的部分家系成員，在未使用氨基糖苷類藥物時也會有耳聾表型。管教授團隊進一步研究中鑑定了影響母系遺傳聾病發生的3個核修飾基因（TRMU、MTO1、GTPBP3），提出核修飾基因突變與m。1555A>G 突變協同作用導致遺感測音神經性聾的“雙重打擊”的新機制，揭示了耳聾患者的遺傳異質性機理。由於線粒體基因突變動物模型的缺失，該機制的組織特異性尚待闡明。該研究透過患者源細胞重程式設計為iPSC，定向誘導分化為內耳毛細胞樣細胞，發現攜帶雙突變時細胞毛束結構和電生理等功能異常，而利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術將核修飾基因突變矯正成為野生型後，誘導獲得的細胞毛束結構和電生理等功能得到重塑。該研究從組織特異性角度，闡明瞭核修飾基因TRMU突變與m。1555A>G 突變協同作用導致遺感測音神經性聾的分子機制，在內耳毛細胞樣細胞中實現了聽覺功能重塑，為耳聾的基因治療帶來“新的曙光”，是領域內的重要突破。

論文簡析

線粒體與能量代謝在聽覺器官發育和毛細胞行使功能中起重要作用。人耳由外耳、中耳和內耳組成，內耳主要包括耳蝸、前庭和半規管等，毛細胞分佈於耳蝸螺旋器（Corti器）的基底膜上，負責接受聲波的機械振動，再由聽神經（蝸神經）傳至大腦，從而產生聽覺。聲電轉導的具體過程為，蓋膜運動引起毛細胞靜纖毛彎曲，離子通道開放，K+順著電壓梯度進入毛細胞，引起毛細胞去極化並釋放化學遞質，經突觸興奮聽神經細胞。因此，內耳中的毛細胞是聽覺功能實現的核心細胞之一。

圖源http：//www。audiocure。com/inner-ear-disorders/

該研究基於同時攜帶TRMU c。28G>T和m。1555A>G突變的阿拉伯以色列家系，首先將正常對照（#3）、僅攜帶m。1555A>G突變（8D）、同時攜帶TRMU c。28G>T純合突變和m。1555A>G突變（20D）的三株永生化淋巴細胞系重程式設計為iPSC，再利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術將攜帶雙突變的iPSC進行遺傳矯正，使其TRMU基因恢復為野生型（C60）。

將四株iPSC平行進行外胚層-內耳毛細胞方向定向誘導分化，分化過程中發現8D分化效率輕微改變，而20D的內耳祖細胞標誌基因表達量顯著降低，且分化的內耳毛細胞樣細胞毛束結構顯著異常，C60的分化效率與8D相近。利用膜片鉗技術對毛細胞樣細胞的電生理特徵進行分析後發現，雙突變株20D的內向鉀電流IK1、外向鉀電流IK在超極化、去極化過程中電流密度異常增大，而8D與C60相較正常對照無顯著差異。結果提示，修飾基因TRMU突變協同m。1555A>G影響iPSC向內耳毛細胞定向分化及毛細胞電生理功能，而對其TRMU基因突變進行遺傳矯正能夠恢復表型。

透過對定向分化獲得的內耳毛細胞樣細胞進行轉錄組測序，分析結果顯示雙突變株的差異表達基因富集於多種影響毛細胞分化和功能的訊號通路，包括神經發育、細胞毛束結構的形成、鉀離子通道、突觸連線及神經遞質釋放等。因此，我們推測TRMU突變與m。1555A>G突變的“雙重打擊”引起了線粒體能量代謝障礙，在內耳毛細胞的分化過程中影響其毛束結構和電生理功能，最終引發耳聾。《“健康中國2030”規劃綱要》、“十四五”規劃和2035年遠景目標明確指出要全面推進健康中國建設，加強出生缺陷綜合防治，提高人口素質。其關鍵在於詮釋遺傳性疾病的分子致病機制，探索新的干預策略。該研究從基因編輯和誘導多能幹細胞定向分化等角度，深入解析了線粒體修飾基因TRMU突變協同線粒體基因突變引發耳聾的致病機制，為耳聾發生的機制研究與精準診療提供了新視角和新思路，為耳聾的基因治療帶來“新的曙光”。

該研究獲得科技部“973專案”、重點研發計劃和國家自然科學基金重點專案等支援。博士後陳潮（浙江大學醫學院附屬兒童醫院）為本文第一作者，浙江大學遺傳學研究所管敏鑫教授為本文通訊作者。

作者簡介

管敏鑫，浙江大學求是講席教授，973首席科學家，中國生物物理學會理事，中國生物物理學會線粒體生物學分會會長，中國聽力醫學發展基金會專家指導委員會副主任委員。1993年獲澳大利亞國立大學博士學位；1993-1999年任加州理工學院博士後；1999-2011年在辛辛那提大學兒童醫院任助理教授、副教授、教授；2011年加盟浙江大學，現任醫藥學部副主任、遺傳學研究所所長。

曾獲5項美國國立衛生研究院RO1基金，主持973計劃，國家自然科學基金重點專案等課題。長期從事遺傳性線粒體疾病的基礎研究和臨床轉化，已建立3000餘家系的母系遺傳性耳聾、2000餘家系的遺傳性視神經病變的佇列，圍繞這些線粒體功能障礙所致出生缺陷的致病機制和精準診治，開拓創新，取得了一系列具有國際領先水平的原創性研究成果並形成重要的理論體系：破解氨基糖苷類抗生素“一針致聾”之謎，發現了3個調控線粒體12S rRNA基因突變耳聾表型表達的核修飾基因TRMU、MTO1、GTPBP3，創新性地提出了核修飾基因和線粒體基因相互作用導致耳聾的新理論；在耳聾患者源的遺傳缺陷型組織中實現iPSC的遺傳矯正，實現聽力功能重塑；鑑定了X連鎖核修飾基因PRICKLE3突變與線粒體基因突變協同作用引發LHON，破解了LHON男性好發這一30年未解之謎，多項成果得到轉化和廣泛應用。

在J Clin Invest、Am J Hum Genet、Nucleic Acids Res、Circ Res等期刊上發表論文248篇；連續8年（2014-2021年）入選“Elsevier生化、遺傳和分子生物學”高被引學者。曾獲2次國家科技進步二等獎、談家楨生命科學創新獎等獎勵；授權國家發明專利11件；主編《醫學遺傳學》等教材；曾擔任美洲華人遺傳學會主席（2007-2008）和亞洲線粒體醫學及研究學會主席（2011-2014）。

本文轉載自公眾號“中國聽力醫學發展基金會”

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原標題：《【科技前沿】管敏鑫教授課題組在Human Molecular Genetics發表基因編輯結合幹細胞技術治療耳聾的新進展》