真核細胞 DNA 的製備與定量檢測-基因組 DNA 提取

真核細胞由什麼組成

製備基因組DNA 是進行基因結構和功能研究的重要步驟，通常要求得到的片段的長度不小於100-200kb。在DNA 提取過程中應儘量避免使DNA 斷裂和降解的各種因素，以保證DNA 的完整性，為後續的實驗打下基礎。一般真核細胞基因組DNA 有107-9bp，可以從新鮮組織、培養細胞或低溫儲存的組織細胞中提取，常是採用在EDTA以及SDS 等試劑存在下用蛋白酶K 消化細胞，隨後用酚抽提而實現的。這一方法獲得的DNA 不僅經酶切後可用於Southern 分析，還可用於PCR 的模板、文庫構建等實驗。

根據材料來源不同，採取不同的材料處理方法，而後的DNA 提取方法大體類似，但都應考慮以下兩個原則：（1）防止和抑制DNase 對DNA 的降解；（2）儘量減少對溶液中DNA 的機械剪下破壞。

一、試劑準備

1。TE： 10mM Tris-HCl （pH 7。8）； 1mM EDTA （pH 8。0）。

2。TBS： 25mM Tris-HCl （pH 7。4）； 200mM NaCl； 5mM KCl。

3。裂解緩衝液：250mM SDS； 使用前加入蛋白酶K 至100μg/ml。

4。20% SDS

5。2mg/ml 蛋白酶K

6。Tris 飽和酚（pH 8。0）、酚/氯仿（酚∶氯仿=1∶1）、氯仿

7。無水乙醇、75%乙醇

二、操作步驟

(一)材料處理

1。新鮮或冰凍組織處理：

⑴ 取組織塊0。3-0。5cm3， 剪碎，加TE 0。5ml，轉移到勻漿器中勻漿。

⑵ 將勻漿液轉移到1。5ml 離心管中。

⑶ 加20% SDS 25 μl，蛋白酶K （2mg/ml） 25 μl，混勻。

⑷ 60°C 水浴1-3hr。

2。培養細胞處理：

⑴ 將培養細胞懸浮後，用TBS 洗滌一次。

⑵ 離心4000g×5min，去除上清液。

⑶ 加10 倍體積的裂解緩衝液。

⑷ 50-55°C 水浴1-2hr

(二)DNA 提取

1。 加等體積飽和酚至上述樣品處理液中，溫和、充分混勻3min。

2。 離心5000g×10min，取上層水相到另一1。5ml 離心管中。

3。 加等體積飽和酚，混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

4。 加等體積酚/氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。如水相仍不澄清，可重複此步驟數次。

5。 加等體積氯仿，輕輕混勻，離心5000g×10min，取上層水相到另一管中。

6。 加1/10 體積的3M 醋酸鈉（pH 5。2）和2。5 倍體積的無水乙醇，輕輕倒置混勻。

7。 待絮狀物出現後，離心5000g×5min，棄上清液。

8。 沉澱用75%乙醇洗滌，離心5000g×3min ，棄上清液。

9。 室溫下揮發乙醇，待沉澱將近透明後加50-100μl TE 溶解過夜。

(三)DNA 定量和電泳檢測

1。DNA 定量：

DNA 在260nm 處有最大的吸收峰，蛋白質在280nm 處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm 處。因此，可以用260nm 波長進行分光測定DNA 濃度，OD 值為1 相當於大約50μg/ml 雙鏈DNA。如用1cm 光徑，用 H2O 稀釋DNA 樣品n 倍並以H2O 為空白對照，根據此時讀出的OD260 值即可計算出樣品稀釋前的濃度：DNA（mg/ml）=50×OD260 讀數×稀釋倍數/1000。

DNA 純品的OD260/OD280 為1。8，故根據OD260/OD280 的值可以估計DNA 的純度。若比值較高說明含有RNA，比值較低說明有殘餘蛋白質存在。OD230/OD260 的比值應在0。4-0。5 之間，若比值較高說明有殘餘的鹽存在。

2。電泳檢測：

取1μg 基因組DNA 用行0。8%瓊脂糖凝膠上電泳，檢測DNA 的完整性，或多個樣品的濃度是否相同。電泳結束後在點樣孔附近應有單一的高分子量條帶。

三、注意事項

1。 所有用品均需要高溫高壓，以滅活殘餘的DNA 酶。

2。 所有試劑均用高壓滅菌雙蒸水配製。

3。 用大口滴管或吸頭操作，以儘量減少打斷DNA 的可能性。

4。 用上述方法提取的DNA 純度可以滿足一般實驗（如Southern 雜交、PCR 等）目的。如要求更高，可參考有關資料進行DNA 純化。